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子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma,EC)是影响妇女健康,最常见的生殖道恶性肿瘤之一。近年来,全世界范围内子宫内膜癌的发病率呈明显上升,并趋于年轻化。尽管子宫内膜癌的治疗方法和意见不断改善,但是晚期患者的治疗仍为困难,五年生存率低、复发率高。仍需进一步探索子宫内膜癌发生发展的机制,寻找可靠的分子治疗靶点并提高癌症预后水平。课题组前期临床研究发现,与正常子宫内膜组织相比,子宫内膜癌组织中SNCG阳性表达率明显增高,并随着淋巴结转移、手术病理分期和肌层浸润深度的增加而增高,SNCG阳性表达组总体生存率明显低于阴性表达组。随后,我们通过Western Blot技术筛选出SNCG蛋白高表达量的人子宫内膜癌HEC-1A细胞株,并筛选出慢病毒质粒载体沉默SNCG基因效果最佳的一组shRNA序列,构建稳定沉默SNCG基因的HCE-1A细胞株,并作为后续实验的细胞模型。随后通过CCK-8法、细胞克隆形成、细胞划痕愈合、侵袭小室、细胞生长周期及细胞凋亡实验发现,SNCG基因沉默后,体外培养的子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力明显减弱,细胞周期阻滞于G1、G2/M期。SNCG基因异常高表达促进子宫内膜癌恶性生物学行为的机制有待我们研究。国内外研究表明,肿瘤的发生发展是一个复杂的多途径分子调控过程。而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路是生物体内重要的,并广泛分布的信号转导系统之一,主要参与细胞的生长、发育、分裂、分化和死亡等多种生化反应信号的识别和传递过程。本研究首先构建人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型,利用蛋白质印迹法检测HEC-1A细胞和裸鼠皮下移植瘤组织中MAPK相关蛋白的表达量,通过体外和体内研究探讨SNCG基因调控MAPK信号通路促进子宫内膜癌恶性生物学行为的分子机制。第一部分人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及SNCG基因对移植瘤生长的影响【目的】构建人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型,并观察SNCG基因稳定沉默对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长情况的变化。【方法】利用细胞传代培养慢病毒质粒载体shRNA处理后SNCG基因稳定沉默的HEC-1A细胞(实验组),和仅转染慢病毒空质粒载体的HEC-1A细胞(空转染组)。将处于对数生长期的两组细胞株分别接种于20只雌性裸鼠右侧肩胛背部皮下,建立人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型。观察裸鼠皮下成瘤情况,并测量皮下瘤长径(L)和短径(W),计算体积(V=1/6π×L×W~2)。4周后处死裸鼠,取出瘤体测量长短径和重量,并液氮冷冻保存。【结果】实验组SNCG基因稳定沉默的人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长速度较空转染组明显减慢(P<0.05)。裸鼠处死日,SNCG基因沉默的实验组移植瘤体积(75.06±85.46)mm~3明显小于空转染组(1112.58±590.90)mm~3(P<0.05);且实验组移植瘤重量为(0.106±0.105)g,明显小于空转染组组(0.951±0.377)g(P<0.05)。【结论】SNCG基因沉默可抑制人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤的生长,所得瘤体为后续信号通路实验奠定组织基础。第二部分SNCG基因调控MAPK信号通路促进子宫内膜癌恶性进展的机制研究【目的】探讨SNCG基因调控MAPK信号通路促进人子宫内膜癌恶性进展的机制。【方法】实验对象:细胞实验组:慢病毒质粒载体sh RNA处理后SNCG稳定沉默的HEC-1A细胞;细胞空转染组:仅转染慢病毒空质粒载体的HEC-1A细胞;瘤体实验组:用SNCG基因沉默的HEC-1A细胞构建的人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤组织;瘤体空转染组:用空转染组HEC-1A细胞构建的人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤组织。通过蛋白质印迹法检测MAPK信号通路的相关蛋白ERK1/2、JNK1/2/3、P38、ERK5及各个磷酸化蛋白的相对表达量,并计算每个MAPK相关蛋白的磷酸化比值。【结果】与细胞空转染组相比,SNCG基因沉默的HEC-1A细胞ERK1+2、JNK1+2+3、P38、ERK5蛋白表达量无明显差异(P>0.05);但p-ERK1+2和p-ERK5表达下降,p-JNK1+2+3和p-P38表达增高;p-ERK1+2/ERK1+2比率和p-ERK5/ERK5比率降低,p-JNK1+2+3/JNK1+2+3比率和p-P38/P38比率增高(P<0.05)。与瘤体空转染组相比,SNCG基因沉默的人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤组织中ERK1+2、JNK1+2+3、P38、ERK5蛋白表达量无明显差异(P>0.05);但p-ERK1+2和p-ERK5表达下降,p-JNK1+2+3和p-P38表达增高;p-ERK1+2/ERK1+2比率和p-ERK5/ERK5比率降低,p-JNK1+2+3/JNK1+2+3比率和p-P38/P38比率增高(P<0.05)。【结论】子宫内膜癌SNCG基因高表达可激活ERK1/2和ERK5信号通路,并抑制JNK1/2/3和P38信号通路,从而促进子宫内膜癌的发生发展。