大麻是一种古老的栽培植物,是许多国家重要的经济作物。但因其含有毒性成分—四氢大麻酚(THC)和大麻二醇(CBD),已被联合国禁毒公约列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一。近年来,毒品问题日益严重。无论是在中国,还是在世界范围内,其都对人类的生存和社会发展构成了严重的威胁。因此,禁毒是摆在世界人民面前的一项迫切任务,而这又是一项极其复杂的系统工程,需要多部门、多领域、多学科的相互配合。这其中非常重要的一种手段就是应用现代的科学检验技术对缴获的毒品进行定性和定量,以便确定其来源,从而使根除毒源成为可能。目前主要是通过传统的化学方法和生物学手段来分析大麻中的毒性成份从而对其进行定性和定量并推断毒源。这些方法在检测中常常需要大量的大麻样品,而且必须是新鲜的,因为四氢大麻酚(THC)在陈旧标本中很容易被氧化,使检验具有一定的局限性。在大麻毒品的案件中,常见的检材是不同条件下放置的干叶或发霉、腐败的陈旧标本,还有一些含脂类物质较多的大麻树脂产品。这些检材在获得时多半是被晒干、切碎的大麻制品,肉眼观察很难与茶叶等外观相近的植物进行分辨。在大麻犯罪案件中还经常缴获到成批未加工的大麻植物,可能来自于同一产地的大麻品种,或来自于不同产地的不同大麻品种,如能鉴别出这些大麻的品种,则能推断所缴大麻的毒源地,为铲除毒品源头提供重要帮助。本研究旨在针对法庭科学中常见的毒品原植物—大麻标本的特点,初步建立适用于实际办案的快速、准确、经济、方便的大麻植物基因组DNA的提取及扩增检测方法,通过DNA分析技术检测大麻的遗传多态性,并能有效的鉴别、鉴定毒品原植物—大麻。目前利用DNA分析技术来检测毒品原植物的特性并鉴定不同产地的毒品原植物正逐渐成为禁毒工作中一项重要内容,为推断毒品的来源开辟了一条新的技术途径。这个新技术的开展将会推动法庭科学对毒物毒品的深入研究,对于禁止毒品流行、禁种禁吸以及对于基层办案和对毒品的检验工作都具有一定的实际意义和使用价值。本实验所开展的工作是国家十一五支撑计划项目的前期内容,其为后续的深入研究奠定了基础,填补了国内毒品原植物DNA检验在法庭科学应用的空白。1新鲜大麻基因组DNA提取方法的建立及大麻特异遗传片段的筛选目的:用改良的SDS方法对新鲜大麻嫩叶进行基因组DNA提取及检测的方法,并筛选出对大麻特异的遗传片段,建立一种稳定、灵敏、实用的毒品原植物大麻DNA检验的方法,为大麻涉毒案件的来源推断奠定基础。方法:对传统的SDS方法略有改动,通过改变提取缓冲液中β-巯基乙醇的终浓度提取了5个品种共20份(雌、雄)新鲜大麻标本的基因组DNA。在提取过程中,先将标本用液氮速冻后粉碎,再经研磨释放DNA然后用SDS裂解缓冲液抽提。提取到的大麻基因组DNA用核酸蛋白定量仪进行定量,用所筛选的引物进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳进行检测大麻的基因组DNA。同时对大麻特异性扩增产物进行了测序。结果:使用改良SDS方法提取新鲜大麻植物标本DNA,获得了清晰的凝胶电泳图谱,从候选的5对植物通用引物中筛选出一对大麻的特异引物,经测序后确定为约190bp大小的片段。应用该对引物扩增非大麻类植物参照标本,未检测到扩增产物。结论:选用改良SDS法提取新鲜大麻植物标本DNA,可以获得高质量的大麻基因组DNA,足以用于进一步检测所需。用所筛选的大麻特异遗传片段可以鉴别大麻与其它植物的种属,对毒品案件的鉴定提供了一种实用、有效的方法。2特殊大麻标本DNA提取方法的建立及不同方法的比较目的:初步建立室温保存10年以上大麻干叶子及大麻树脂的基因组DNA提取方法。建立稳定的从降解严重陈旧的大麻标本获得高质量DNA的提取方法。方法:用SDS法、CTAB法、改良高盐低pH法、碱裂解法及磁珠纯化的方法对特殊陈旧大麻检材进行基因组DNA提取,通过比较以确定最佳的提取方法。即高盐低pH方法,提取了新鲜大麻标本和陈旧大麻(树脂)标本的DNA,模板DNA经定量后选择最适浓度为5～10ng/μl,应用大麻叶绿体trnL intron的引物进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增产物。结果:在SDS法、CTAB法、改良高盐低pH法、碱裂解法这4种提取大麻基因组DNA方法中,尤以改良高盐低pH方法最佳,得到了纯度较高、片段较完整的大麻基因组DNA。经检测获得了10年以上大麻干叶及大麻树脂的清晰凝胶电泳图谱,其中成功提取了1份22年陈旧大麻树脂标本的DNA。结论:该方法操作简便、实用,对于陈旧、降解的特殊大麻标本及大麻树脂产品DNA的提取效果尤佳。同时该方法可用于检测大麻植株来源,对于法庭科学的研究和实际检案均具有重要的意义。3特异的大麻性别位点研究目的:设计对大麻雄性植株特异的引物,以鉴别具有经济价值的大麻雄性植株,尤其在大麻幼苗期能够区分开具有药用价值和滥用潜力的大麻雌性植株和经济价值的雄性植株,以期在毒品案件中能从DNA水平上识别大麻雌、雄样本。方法:用SDS法、改良高盐低pH法和磁珠法提取新鲜和陈旧大麻雌、雄标本及大麻树脂标本的基因组DNA,使用“Primer Premier 5.0”软件设计引物PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果:自行设计的引物经PCR扩增得到约300~320bp大小的产物片断,在电泳检测时,只有Ym21、Ym23、Ym26、Ym71四种雄性大麻标本全部出现了清晰的谱带,而同样条件下扩增的六种陈旧雌性大麻标本均未检测到谱带。结论:初步认为这对引物的扩增片断长度在大麻植株雌、雄性别间存在差异。但尚需分析更多的标本,并进行序列测定,进一步明确引物的种属特异性及性别特异性。4大麻STR位点的遗传多态性研究目的:研究CS1和ANUCS305 STR位点在中国不同地区大麻中的遗传多态性,并探讨其在法庭科学中的应用。建立稳定、灵敏、实用的大麻STR位点的分析检测方法,对不同大麻品种的个体进行遗传多样性分析,检验结果能够有效的鉴别、鉴定毒品原植物大麻。通过研究初步尝试利用STR分析技术推断涉毒案件中所缴大麻的来源地。方法:以5-FAM荧光染料标记设计、改进、筛选的CS1和ANUCS305两个STR位点,对云南大麻四个品种62株个体进行PCR扩增,通过ABI310/3100毛细管电泳基因型分析仪,建立快速、高通量的荧光检测体系,使用GenAlEx6软件进行遗传多态性分析。结果:两个STR位点的多态性均较高,其等位基因数在7-26之间,多态信息含量在0.43-0.90之间,有效等位基因数在2.040-10.449之间,杂合度在0.250-0.923之间。通过GenAlEx6软件分别计算出了四个云麻品种之间的Nei’s遗传距离,然后使用UPGMA法绘制了云麻四个品种组成的系统聚类图。结论:所选CS1和ANUCS305STR位点具有较高的遗传多态性,若能开发出更多此类位点,并能采集较多不同来源地的标本进行分析建档,以此建立起完整的全国大麻稀有等位基因数据库和各品种间聚类系统树,可使大麻品种间的鉴定成为可能,同时也能提高推断毒品原植物大麻的来源地及其在实际案件的刑事鉴定上的应用价值。结论本研究从新鲜大麻DNA提取及特异引物的筛选、特殊大麻标本DNA提取、特异的大麻性别位点、大麻STR位点的遗传多态性等几个方面对毒品原植物大麻的DNA检测技术进行了的研究,建立了大麻DNA提取及检测方法,对涉毒案件中毒品原植物的检验奠定了基础。1本研究选用SDS法提取新鲜大麻植物标本DNA,可以获得高质量的大麻基因组DNA。2本研究对所选择的几种提取特殊大麻标本的方法进行了研究,实验表明改良高盐低pH方法最佳,得到了纯度较高、片段较完整的大麻基因组DNA。并获得了10年以上大麻干叶及大麻树脂的清晰凝胶电泳图谱。3本研究自行设计的一对大麻雄性引物,经PCR扩增得到300~350bp大小的产物片断,电泳检出雄性大麻标本的清晰谱带,而未检测到同样条件扩增的雌性大麻标本和非大麻植物对照标本的谱带。4本研究对毒品原植物大麻的CS1和ANUCS305STR两个STR位点多态性进行了研究,并通过GenAlEx6软件分别计算出了四个云南大麻品种之间的Nei’s遗传距离,然后使用UPGMA法绘制了云南大麻四个品种组成的系统聚类图。研究结果证实:这两个STR位点具有较高的遗传多态性,其等位基因数在7-26之间,多态信息含量在0.43-0.90之间,有效等位基因数在2.040-10.449之间,杂合度在0.250-0.923之间。