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中药灵芝为多孔菌科灵芝属真菌赤芝,是传统的名贵中药,在我国已有两千多年的药用历史。灵芝具有广泛的生物活性,如调节机体免疫、保护神经系统、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等。目前关于灵芝的研究主要集中在其化学成分,而关于灵芝中microRNA(miRNA)的研究却鲜有报道。本论文在课题组前期研究的基础上对灵芝miRNA的功能展开了初步研究分析,探索灵芝miRNA靶向人衰老发生过程的作用机理,为研究灵芝miRNA的分子作用机制奠定了理论基础,为植物miRNA调控动物靶基因的研究提供了新的证据。首先,本文采用灌胃实验,对实验小鼠分别连续灌胃新鲜灵芝提取液、灵芝孢子粉溶解液和灵芝总RNA提取液,利用qRT-PCR检测小鼠各脏器中灵芝特异miRNA glu-miR-01的表达水平。结果显示,相对于对照组,实验小鼠各脏器中灵芝glu-miR-01的含量明显升高,表明glu-miR-01能经灌胃进入到小鼠各脏器。为了进一步验证上述实验结果,本文利用qRT-PCR检测了 0.5 h/3 h/6 h/9 h后,新鲜灵芝提取液、灵芝孢子粉溶解液和灵芝总RNA提取液三个实验组的小鼠脏器中glu-miR-01的表达水平。结果显示,实验组小鼠各脏器中灵芝glu-miR-01的含量相对于对照组明显升高,表明在0.5h/3h/6h三个时间段在小鼠各脏器中依旧能检测到glu-miR-01的表达。其次,本文利用TargetScan和RNAhybrid软件预测灵芝特异miRNA glu-miR-01在人体内的靶基因,并进行KEGG分析,结果表明:glu-miR-01能分别靶向mTOR信号通路中的四个关键基因PI3K、Akt、mTOR和S6,提示我们glu-miR-01具有调控PI3K/Akt/mTOR信号通路上某些关键基因的潜在功能。随后,将合成的 glu-miR-01 mimics 以及 negative control 分别转染至 293T 细胞中。Western Blotting结果显示,glu-miR-01 mimics能够显著下调PI3K/Akt/mTOR信号通路上的关键蛋白p-Akt/p-S6。已经有大量文献报道内源性miRNA可以调控PI3K/Akt/mTOR信号通路上关键蛋白,进而影响人体的衰老以及衰老相关疾病的发生和发展。我们的发现为后续开展灵芝miRNA在抗衰老作用机制的深入研究提供了新的思路。最后,进行了细胞学实验,采用H2O2作为氧化剂,构建细胞损伤或凋亡模型。利用MTT法观察H2O2对人皮肤成纤维细胞(HSF)存活的影响,根据细胞半数存活率,确定诱导条件为:0.8mMH2O2诱导3h。利用该诱导模型,进一步证实了 glu-miR-01的干预对细胞氧化损伤及凋亡具有一定的防护作用,能够逆转H2O2引起的HSF细胞SOD降低、MDA升高,表明灵芝glu-miR-01对H2O2造成的HSF细胞氧化损伤有保护作用。这些研究结果为深入研究灵芝miRNA的生物功能提供了新的理论基础,为灵芝miRNA在调控动物相关基因的表达进而影响抗氧化、抗衰老的应用提供了科学依据。