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非共价相互作用是指通过非共价键合力而形成的相互作用。特异性非共价相互作用体系在生命体中广泛存在,其研究和应用对于生命科学、临床医学等领域都具有重要意义。本论文选取了两个代表性的特异性非共价相互作用体系(即核酸适体与其靶分子体系、抗原与抗体体系)进行研究。
对于新兴的核酸适体与其靶分子体系,本论文建立了两种电泳方法对其相互作用进行了分析。
(1)化学发光标记的核酸适体作为探针用于毛细管电泳相互作用分析:本论文首次提出并实现了采用化学发光试剂(异硫氰酸基异鲁米诺)对核酸适体进行共价修饰,并采用高效液相色谱-质谱法表征和纯化,获得了较纯的化学发光单标记的核酸适体。本论文还搭建了毛细管电泳-化学发光装置,采用该实验装置研究了标记的核酸适体与其靶分子凝血酶的相互作用,三种计算方法所得实验结果与文献报道值一致,证明了方法的有效性。本论文所提出的标记方法简单、有效,易纯化,适用于任何核酸适体,是一种广普性、易推广的方法。本论文所搭建的装置简单、廉价,易于实现推广。再结合核酸适体靶分子的广泛性,本论文所建立的方法将可能在相互作用分析中得到广泛应用,为揭示生命过程奠定基础。
(2)连续性前沿分析芯片电泳法研究溶菌酶与其核酸适体的相互作用:本论文首次提出了利用连续性前沿分析芯片电泳法研究核酸适体与其靶分子的相互作用。为抑制核酸适体和蛋白质在芯片通道表面的吸附,本论文采用羟丙基纤维素对分离微通道内壁进行了涂层。结合激光诱导荧光检测,优化实验条件,获得核酸适体的LOD为10 nM(S/N=2),线性范围为20~500 nM(R2=0.996)。采用两种分析模式(即改变核酸适体浓度而固定溶菌酶浓度的模式、改变溶菌酶浓度而固定核酸适体浓度的模式),测定了溶菌酶与其核酸适体的解离常数,所得值与文献报道值相一致。实验发现X-倒数法中能进行分段拟合,结果显示:随核酸适体相对浓度的增加,溶菌酶与其核酸适体的亲和力而增加、结合位点数减少;推测该相互作用过程是首先以特异性相对较差的较弱亲和力结合,然后由于分子间竞争而致使两者的表观亲和力增强、相互作用特异性增加。本论文所提出的连续性前沿分析芯片电泳法有效、简单、快速,适用于任何核酸适体及其靶分子相互作用的研究。
对于经典的抗原与抗体体系,本论文利用其相互作用的高特异性,建立了基于微柱阵列芯片的新型免疫诊断方法。制作了微柱阵列芯片,优化了用其实现标准蛋白等电聚焦分离的条件(包括甘油浓度和琼脂糖浓度)。详细研究了甘油浓度对等电聚焦时间的影响和聚焦过程中的蒸发机制。为抑制蛋白质吸附,在微柱阵列区域表面采用了PDMA-AGE涂层。将过敏原性蛋白与非过敏原性蛋白在其上实现分离,结合免疫印迹,进行了病人血清中IgE的定性测定,实现了病人过敏症的诊断,是针对过敏原性蛋白的分子免疫诊断。实验结果与经典ELISA方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳方法一致,证明了该免疫诊断方法的有效性。该免疫诊断方法相较常规经典方法,分析速度更快、样品消耗量更低(10μL病人血清),适用于过敏症的临床诊断,有望在临床上得到进一步应用。