血管新生是指从已有血管形成新血管的过程,包括已形成血管的去稳定化、内皮细胞的增殖、迁移和成管等多个步骤。血管新生与肿瘤密切相关,在肿瘤生长的血管期,新生血管向肿瘤表面及内部延伸,为肿瘤的生长提供持续的营养和氧气,肿瘤的生长和转移依赖于血管新生,因此,抑制肿瘤血管新生是肿瘤治疗的有效策略。血管新生是复杂的动态平衡过程,受体内多种促进因子和抑制因子的调节,在促进因子中,血管内皮生长因子(VEGF)是血管新生的重要调节物,VEGF的相关受体有三种(VEGFR-1、2、3),普遍认为VEGFR2为主要介导物。在内皮细胞中,活化的VEGFR2调节下游一系列血管新生调节因子,包括JaK2/STAT3、MAPK和FAK信号通路中的成员。之前的研究表明,蛋白／多肽类药物(Trastuzumab、 Bevacizumab等)和人工合成化合物(Sorafenib、Temsirolimus等)通过下调VEGFR2介导的信号途径抑制肿瘤血管新生,对肿瘤生长和转移具有明显的抑制效果,其中酪氨酸激酶抑制剂Sorafenib和Sunitinib等已经被FDA批准用于临床肿瘤的治疗,说明靶向VEGFR2相关信号途径是治疗肿瘤的有效途径。我国拥有丰富的中草药资源,从中筛选、鉴定新的抗肿瘤血管新生抑制剂,并研究其分子机理具有重要意义。我们初步筛选了10种中草药单体和29种合成的小分子化合物,发现其中10种可以不同程度地抑制血管新生,通过体外、体内的进一步实验,鉴定出3种新的血管新生抑制剂,并发现它们可以抑制肿瘤生长和转移,同时揭示了其中的分子机制。本研究内容分为四部分,概括如下：1.葫芦素E(Cucurbitacin E, CuE)是一种从传统中草药甜瓜蒂中提取的四环三萜类化合物,以前的研究表明CuE具有抑制癌症细胞增殖、抗炎症的活性。但是,CuE对肿瘤血管新生的作用及其潜在的分子机制尚无报道。在本研究中,我们证实CuE在体外能有效地抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和成管,在体内能够显著抑制鸡胚尿囊膜血管新生,以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的小鼠角膜血管新生。我们发现CuE显著诱导内皮细胞的凋亡,在荷瘤模型中通过抑制血管新生抑制肿瘤的生长。机理研究发现,CuE通过抑制VEGFR2介导的JaK2/STAT3信号通路,从而抑制了下游蛋白的活性。该研究为CuE抑制肿瘤血管新生提供了有力证据,并揭示了其潜在的分子机理,同时为CuE作为血管新生相关疾病治疗的潜在候选药物提供了理论依据。2.我们研究的另一种小分子化合物为冬凌草甲素(Oridonin),它是从中草药冬凌草中提取的,已有研究显示它具有抗炎和抗肿瘤细胞增殖的作用,而其对肿瘤血管新生和肿瘤生长及转移的作用及其分子机制尚不清楚。Notch信号通路是介导细胞间相互作用的信号通路,参与肿瘤生长和肿瘤血管新生,研究Notch信号通路在血管新生相关方面的报道相对较少。在HUVECs中, Notch由多个配体(Dll1、Dl14、 Jagged1和Jagged2)激活,开启下游信号通路。在本研究中,我们发现Oridonin对肿瘤血管新生、肿瘤生长和转移具有明显的抑制作用。并且,我们发现Oridonin能够调节VEGF诱导的Notch级联反应,抑制Jagged2诱导的Notch1的活化,从而抑制HUVECs微管样结构的形成。进一步发现,Oridonin调节Jagged2mRNA的表达,也调控Notch1下游靶基因如Hes-1、HESR1和c-Myc等mRNA的表达,上述基因与血管的数目和微管样结构的形成密切相关,也与肿瘤的发展密切相关。以上结果证明,Oridonin通过调节Notch信号通路抑制肿瘤血管新生,进一步抑制肿瘤生长和转移。3.血管新生发生在一系列眼部疾病中,尤其是与视网膜病变相关的疾病,其中包括增生性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变和继发性新生血管性青光眼等,这些眼部疾病往往导致血管新生,继而失明。在介导血管新生的信号通路中,FAK/Paxillin信号通路是调节细胞运动的关键通路,并且FAK的过度表达能够诱导视网膜病理性血管新生。前面的结果已经证明在体外、体内实验及小鼠疾病模型中,Oridonin具有显著的抗血管新生作用,尚不明确Oridonin在视网膜病变中的相关作用。本论文中,我们在体外和体内两个方面研究了Oridonin在视网膜血管新生中的作用,以及相关分子机制。体外实验结果表明,Oridonin能够有效的抑制猴视网膜内皮细胞的增殖、迁移和成管；缺氧诱导的小鼠体内模型发现,Oridonin能够显著抑制视网膜血管新生；检测缺氧诱导小鼠视网膜中的蛋白发现,Oridonin明显下调了FAK和Paxillin的磷酸化。因此,Oridonin限可能成为视网膜血管新生性疾病治疗中有效的候选药物。4. Fatostatin是靶向于固醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding proteins, SREBPs)激动剂SCAP的小分子化合物,能够明显下调SREBPs的活性。SREBPs是血管新生的关键蛋白。在本研究中,我们基于Fatostatin设计了一系列小分子化合物,通过体外和体内的实验筛选出对血管新生抑制作用较强和细胞毒性较小的WB339进行深入研究,体内实验发现WB339能够显著抑制肿瘤生长、血管新生和肿瘤转移。进一步分析发现WB339的化学结构与溶血磷脂酸(LPA)的类似物结构相似。有文献报道LPA的类似物通过拮抗LPA对G蛋白耦联受体(GPCRs)的激活作用,而抑制前列腺癌细胞的增殖。LPA是一类由多种类型细胞分泌到细胞表面的结构简单的天然磷脂,通过激活其受体,即特定的GPCRs(LPA1),开启下游的信号通路。GPCRs广泛分布于多种类型细胞表面,在发育过程中及执行正常的生理功能中发挥着重要的作用,鉴于其广泛而关键的作用,以此为靶点设计小分子化合物来调节相应的信号通路,使之处在正常的活化范围具有重大意义。机理探讨发现,WB339对SREBPs的活性几乎没有影响；同时发现WB339能够抑制HUVECs中LPA1mRNA的表达,WB339对LPA1及其下游信号通路中蛋白的影响的工作正在进行中。另外,Western Blot检测发现WB339显著抑制了黏着斑激酶(FAK)的活化。细胞免疫荧光实验结果显示：板状伪足特异性蛋白Paxillin活性下降且应力纤维(F-actin)排布有显著变化,该结果从另一个方面印证了WB339确实可以通过抑制内皮细胞中黏着斑蛋白的活性来调节肿瘤血管新生,从而抑制肿瘤生长和转移。综上所述,WB339很可能是潜在的抗肿瘤生长和转移的候选药物。以下进一步的机理研究正在进行：1.WB339对HUVECs中FAK信号通路和LPA1信号通路的调节情况；2.相应信号中WB339的潜在靶点。综上所述,本研究筛选并鉴定了三种小分子化合物(葫芦素E、冬凌草甲素、WB339)为新的血管新生抑制剂,并验证它们可以通过抗血管新生抑制肿瘤生长和转移；深入研究小分子化合物抑制肿瘤血管新生的相关细胞信号通路,及其潜在靶点,揭示了小分子化合物抗肿瘤的新机理；本研究还建立并完善肿瘤血管新生研究的系列模型(包括体外、体内、疾病及分子机理模型),为肿瘤血管新生研究提供了研究范例,同时为抗血管新生治疗肿瘤提供候选药物。