遗传疾病是指遗传物质改变而导致的疾病,且能由亲代传递于后代。人们已经发现多种眼睛疾病与遗传相关如原发性先天性青光眼(Primary congential glaucoma,PCG;OMIM231300)、视网膜母细胞瘤、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP;OMIM226800)、先天性红绿色盲、高度近视等。其中,PCG和RP是两种非常严重的遗传致盲性疾病。目前,虽然有不少RP和PCG的致病基因及突变位点得到了鉴定,但这些基因及突变并不能完全解释所有患者的患病,提示仍然有新的致病基因或突变位点存在。定位克隆、功能克隆等方式是发现这些疾病致病基因的重要手段。但其具有一定局限性,例如某些疾病家系信息难以收集,疾病的生理生化机制不明等。随着测序技术的不断发展,全外显子组测序(Whole-exomesequencing,WES)技术在遗传疾病研究中的应用越来越广泛。该技术利用序列捕获方法将全基因组范围外显子区域的DNA捕获并富集后进行高通量测序。另外,该技术还具备灵敏度高,花费低,能够同时发现已知致病基因和未知致病基因突变等优势。本课题组采用WES技术对RP和PCG患者进行测序,以期发现新的致病基因或新的突变位点,并进一步利用细胞生物学和动物模型等初步功能研究来验证新的致病基因的可靠性。结果显示,1)在印度RP人群中,我们发现了已知致病基因EYS的新突变。这些突变包括三对复合性杂合突变c.[8422G>A];[7868G>A]、c.[4606c>g];[5038a>g]和c.[1418g>t];[2971c>t],7个纯合突变c.[1872g>a]、c.[8455dela]、c.[9059t>c]、c.[8388c>a]、c.[7187g>c]、c.[2259+1g>a]和c.[3024c>a]。2)对于课题组前期鉴定的pcg新候选基因p-x,我们进行了初步的功能学研究。生物信息学预测结果显示,该基因突变位点c.c58t(p.r20x)和c.a232g(p.i78v)的氨基酸残基位于蛋白β折叠区;并且前者可导致截断蛋白的产生,后者突变氨基酸残基位于β-折叠与α-螺旋连接处,而该区域位于p-x蛋白gtp酶活性区;在mrna水平,该基因在人和小鼠视网膜均有表达,此外在小鼠的视网膜色素上皮、虹膜、睫状体、视杯、晶状体和角膜都也有表达。在蛋白水平上,通过组织免疫荧光实验发现,该基因在人视网膜感光细胞及神经节细胞有较强表达;在小鼠视网膜、房角,虹膜等部位有较强表达。生物细胞学实验结果显示,该蛋白主要表达于细胞浆;并且通过构建突变型质粒,我们成功地验证了突变位点对蛋白表达的影响。其中,突变位点c.[58c>t]使得蛋白表达缺失,而c.[232a>g]突变则出现蛋白在细胞内的分布出现异常。这些结果与生物信息学预测结果一致。3)对于基因p-x体内功能的研究,我们在斑马鱼中,通过显微注射morpholino(mo)阻抑p-x蛋白表达,发现斑马鱼眼睛的发育受到了影响,表现为眼睛变小,神经节细胞、视杆细胞、视锥细胞变少,分布异常。为了检测其原因,我们通过tunel方法标记凋亡细胞,磷酸化组蛋白抗体标记增殖细胞,结果发现阻抑p-x蛋白表达的斑马鱼视网膜细胞增殖异常,而凋亡与正常对照无差异,提示p-x可能通过影响视网膜细胞的增殖而参与了pcg的发病。然而,其具体机制有待进一步研究。综上所述,1)我们通过全外显子测序技术,发现了印度rp患者已知致病基因EYS的新突变位点包括三对复合性杂合突变,7个纯合突变,丰富了RP致病基因突变谱;2)对前期发现的PCG可能致病基因P-X及其突变c.[58C>T]和c.[232A>G]进行了初步的功能研究。结果发现,该基因可能通过影响视网膜细胞增殖而影响眼睛发育,从而导致PCG的发生。