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小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)是能够感染羊等小反刍动物的烈性传染病病源。N蛋白为PPRV的核蛋白,具有较好的免疫原性。本研究构建了原核表达质粒pET-28a-N,纯化了PPRV原核表达蛋白,制备了抗PPRV N蛋白的单克隆抗体,构建了表达PPRV N蛋白的Bac-PPRV-N,在此基础上建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法,为PPRV的临床诊断提供有效的工具。具体研究内容如下:1.PPRV N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定利用原核表达系统,表达了PPRV的N蛋白。将纯化的蛋白免疫小鼠,通过细胞融合及亚克隆,筛选出了六株可稳定分泌抗PPRV N蛋白的单克隆抗体,分别命名为:1H5、2H5、1A7、1G5、1A6和2F5。经鉴定,筛选到的六株单抗均为IgG,其亚型均为IgG2b,轻链均为Kappa链。通过IFA和Western Blot分析,所制备的六株单抗均能够特异性识别PPRV N蛋白。通过将N基因截短表达,经Western Blot检测,单抗1H5、2H5、1G5、2F5识别的抗原表位位于N基因的112aa-144aa的氨基酸区域;单抗1A7、1A6识别的抗原表位位于N基因的144aa-240aa的氨基酸区域。利用PPRV阳性参考血清、阴性参考血清对所筛选的抗体进行了阻断活性的检测,验证了筛选的单抗1H5、2H5、1A7、1G5、1A6和2F5的阻断率分别为79.28%、71.74%、93.32%、84.29%、73.82%、74.49%。2.PPRV N蛋白杆状病毒表达质粒的构建在杆状病毒表达系统里利用pFastBac HTB载体构建了穿梭质粒Bac-PPRV-N。将构建的重组质粒转染sf9细胞,拯救重组杆状病毒Bac-PPRV-N。通过IFA和Western Blot分析,Bac-PPRV-N重组杆状病毒表达的PPRV N蛋白能够与N蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。3.PPRV阻断ELISA抗体检测试剂盒的研发将亲和层析纯化的原核表达N蛋白作为包被抗原,具有阻断活性的单抗1A7进行HRP标记作为酶标二抗,通过优化各个反应条件,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。通过与法国ID.VET公司生产的PPRV抗体检测试剂盒进行比较,共检测临床血清样品262份,其总符合率为94.2%。与青岛瑞尔生物有限公司生产PPRV阻断ELISA抗体检测试剂盒进行比较,共检测临床血清样品241份,其总符合率为97.9%。批间重复试验与批内重复试验的验证中,该试剂盒的变异系数在10%以内,说明,该试剂盒重复性良好。特异性实验、敏感性实验及保存期实验表明,本研究的建立的阻断ELISA检测方法,敏感性高,特异性强,适用于临床检测PPRV抗体。