研究背景：骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化的潜能,在经典研究中,它被认为是骨细胞和成软骨细胞、成纤维细胞的共同起源细胞,对骨和软骨的发生非常重要。体外培养骨髓间充质干细胞的的相关研究中发现,在合适的环境和条件下,骨髓间充质干细胞能够在体外进行34—42次的分裂增殖,增殖过程中始终保持梭形并呈漩涡状排列。不仅如此,骨髓间充质干细胞在冷冻保存进行复苏后,仍然具备干细胞的特性。BMSCs不仅存在于骨髓中,还游离于骨组织外。当其在适当信号刺激时,可游离出骨组织,到达效应靶器官组织中,这种生物学行为叫“归巢”。细胞的归巢能力与细胞周期紧密相关,且由复杂分子相互作用才能介导其在骨髓内的识别与定植,因此骨髓间充质干细胞在临床应用中表现了良好的前景。脂肪组织是调节机体能量平衡的器官,通过调节脂肪和糖代谢动态维持代谢与体温的稳定,而且能够作为重要的屏障缓冲机械力的冲击,保护内脏。目前,肥胖以及由肥胖造成的代谢疾病在世界范围内对人类健康产生了严重的威胁,而这些疾病的出现,与脂肪细胞的分化和功能存在密切关系。BMSCs分化成脂肪细胞受细胞外信号和转录水平的级联放大调控,这需要大量基因表达之间的精细时空调节。在哺乳动物中过氧化物酶受体激动剂(peroxisome proliferator activated receptor y, PPARy)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein a, C/EBPa)是成脂分化过程中的关键调节因子。PPARy在前体脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中被诱导,并且在此过程中是必需的。缺少它,前体细胞不能分化为成熟的脂肪细胞,而且PPARy能够促进C/EBPa缺失的细胞进行成脂分化。反过来,C/EBPa不能够促进PPARy缺失的细胞完成脂肪分化。虽然缺少C/EBPa的细胞能够完成脂肪分化,但是这个分化细胞是有缺陷的,它们只能聚集少量的脂肪滴,并且不能诱导PPARy的表达,这指示PPARy和C/EBPa的相互作用在整个成脂分化过程中的作用非常重要。基于成脂转录因子的重要性,现有证据表明,PPARy和C/EBPa的激活是由转录因子、共激活因子和共抑制因子相互作用共同来完成的,其中组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶利用遗传学调控,发挥着巨大的作用。核受体辅助抑制因子(nuclear receptor corepressor, NCoR)属于核受体辅助抑制因子家族中的一员,其发挥转录抑制作用主要是通过募集HDAC,例如HDAC1, HDAC7, HDAC4, HDAC3及Sirt1等,并且已经清楚表明HDAC3募集形成的复合物对甲状腺受体的转录抑制功能是必需的。近年来发现NCoR可以与HDAC结合成复合物,通过影响蛋白的转录,在机体代谢、炎症以及肿瘤发生中扮演着重要角色。下调辅助抑制因子的表达会打破辅助抑制因子和辅助激活因子在染色质结构、转录、DNA修复、炎症以及其他生物进程调节中的平衡,进而易化肿瘤的发生。辅助调节因子也可能通过不同调节机制在不同类型癌症或白血病中发挥着抗肿瘤的作用。另外研究发现,沉默(或敲除)NCoR基因可以通过增加PPARγ的转录活性进而促进3T3-L1细胞的脂肪分化。Pingping LI等特异性沉默小鼠脂肪细胞中NCoR基因,发现PPARγ的转录活性增强,脂肪细胞增生,局部炎症减轻。近年来,PPARγ被发现扮演着成脂与成骨分化通路中的分子开关,PPARγ过表达后会抑制Runx2的表达,从而使间充质干细胞向脂肪细胞分化。Jackson及其同事发现高浓度的PPARγ配体可抑制前成骨细胞MC3T3-E1细胞向骨细胞分化,并可通过过表达PPARγ诱导MC3T3-E1细胞分化为成熟的脂肪细胞。研究发现NCoR可通过GPS2与活化的PPARγ结合,抑制活化的PPARγ介导的转录。NCoR协同HDAC9抑制PPARγ的活性进而抑制破骨细胞增生,在骨重塑中发挥重要作用。那么NCoR对骨髓间充质干细胞的脂肪分化有何影响呢?本文通过RNA干扰技术及基因过表达技术,干扰或过表达BMSC中NCoR基因的表达,观察BMSC的脂肪细胞分化过程,检测其中关键转录因子的表达,详细阐述NCoR对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响。研究目的：构建NCoR siRNA和pCMV-NCoR载体,为后续细胞学实验奠定基础。将NCoR siRNA和pCMV-NCoR转染骨髓间充质干细胞,观察NCoR对BMSCs的生长及增殖的影响,以及和胰岛素在BMSCs增殖方面的作用关系,为BMSCs生长增殖的研究提供一定依据,并为BMSCs作为种子细胞的移植治疗提供实验基础。然后将NCoR siRNA和pCMV-NCoR转染BMSCs,成脂诱导培养,观察NCoR对BMSCs成脂分化及增殖的影响,为今后糖脂代谢异常、肥胖等的研究和治疗提供一定的实验理论基础。研究方法：1、根据NCoR siRNA靶位点的选择原则,从GenBank数据库中择优选取三条siRNA序列,通过构建干扰及过表达载体,筛选出最佳序列。2、检测NCoR对BMSCs增殖的影响。在96孔板上按1×106/孔接种大鼠BMSCs,设置空白对照组、阴性对照组(无目标siRNA)、pCMV-N1、NCoR siRNA和pCMV-NCoR组,每组设3个复孔。从转染后第1天开始,每天同一时间消化每组细胞3个孔,连续5d,细胞计数器计数绘制各组细胞的生长曲线图,MTT法检测细胞增殖率。3、观察NCoR和胰岛素在大鼠BMSCs增殖过程中的关系。设置空白对照组、阴性对照组(无目标siRNA)、pCMV-N1、NCoR siRNA和pCMV-NCoR组,采用Ommol/L、5mmol/L、15mmol/L及45mmol/L浓度的胰岛素处理各组细胞3d后,细胞计数器和MTT法分别检测细胞的生长与增殖,评估NCoR和胰岛素在大鼠BMSCs增殖过程中的作用关系。4、观察NCoR对大鼠BMSCs诱导成脂分化后细胞增殖的影响。为探讨NCoR对大鼠BMSCs诱导生成脂肪细胞增殖的影响,当细胞达到65%融合度时,转染NCoR siRNA及pCMV-NCoR质粒,成脂诱导,并在转染后不同时间点,应用MTT法检测其细胞增殖,并应用Western Blot检测NCoR的干扰效率及过表达效率。5、观察NCoR对大鼠BMSCs诱导成脂分化的影响。BMSCs在成脂培养液中培养2d后,转染NCoR siRNA及pCMV-NCoR质粒,2d后检测细胞成脂分化。油红O染色后显微镜观察细胞中脂肪滴积累情况。Western Blot和实时RT-PCR检测脂肪分化相关的三个基因PPARγ、C/EBPa与LPL的变化。结果：1、成功构建了NCoR siRNA及pCMV-NCoR质粒载体,并筛选了最佳干扰序列,载体由广州Cyagen生物科技公司合成。2、NCoR siRNA可使BMSCs的增殖降低。与对照组相比,第1d三组细胞数量差异不大。从第3d开始,NCoR siRNA组细胞数量及增殖明显低于对照组,而pCMV-NCoR组细胞数量及增殖明显高于对照组。倒置显微镜观察结果显示,与对照组相比,NCoR siRNA及pCMV-NCoR组大鼠BMSCs的形态无明显差别,提示NCoR可促进BMSCs增殖。3、NCoR siRNA可减弱胰岛素对BMSCs增殖的促进作用。5mmol/L浓度的胰岛素促进了细胞生长及增殖,但作用不明显,15mmol/L浓度的胰岛素明显增加了BMSCs的生长与增殖率,但45mmol/L浓度的胰岛素不能促进细胞的生长及增殖。NCoR基因沉默后,不同浓度胰岛素对BMSCs细胞生长与增殖影响均减弱。而过表达NCoR后,各种浓度胰岛素对BMSCs的细胞生长及增殖作用均得到加强。4、NCoR siRNA可促进大鼠BMSCs成脂分化后细胞增殖。与对照组相比,NCoR siRNA组的增殖明显增强,而NCoR过表达组的增殖则明显降低(P<0.05)。NCoR过度表达导致细胞活性显著下调只是在特定的时间,而不呈现时间依赖性。5、NCoR负性调控大鼠BMSCs的成脂分化。与对照组相比,NCoR siRNA组细胞内的脂肪滴明显增加。对其增殖的检测显示,NCoR siRNA组的OD值显著高于对照组。此外,Western blot和实时RT-PCR对脂肪分化相关的三个基因PPARy、C/EBPa与LPL的检测显示,与对照组相比,NCoR siRNA组C/EBPα、PPARy包括PPARyl与PPARy2蛋白表达上调(P<0.05),LPL mRNA表达也显著增加(P<0.01)。而NCoR过表达组细胞内脂滴的积累明显减少。NCoR过表达明显抑制了细胞的增殖。pCMV-NCoR组C/EBPα、PPARy包括PPARγ1与PPARy2和LPL mRNA表达显著降低(P<0.01)。结论：我们利用RNA干扰技术成功设计并构建了NCoR基因特异性的小干扰siRNA,以及设计并构建了NCoR基因过表达质粒。经证实,基因沉默或过表达效果良好。我们成功将NCoR siRNA和pCMV-NCoR转染至大鼠骨髓间充质干细胞内,并证实转染效率较高。然后检测BMSCs的增殖发现,NCoR siRNA组BMSCs的增殖速率明显下降,提示NCoR可促进BMSCs的增殖。BMSCs在不同胰岛素浓度下培养,发现15mmol/L浓度的胰岛素明显增加了BMSCs的生长与增殖率,而NCoR基因沉默后,不同浓度胰岛素对BMSCs细胞生长与增殖影响均减弱。但是过表达NCoR后,各种浓度胰岛素对BMSCs的细胞生长及增殖作用均得到加强。这提示NCoR和胰岛素在大鼠BMSCs的生长及增殖过程中存在一定的作用关系。沉默NCoR时,大鼠BMSCs诱导成脂分化,脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、PPARy和LPL的表达明显增强,过表达NCoR基因时,C/EBPα、PPARy和LPL的表达明显降低,提示NCoR负性调控大鼠BMSCs的成脂分化及增殖。