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本论文的工作是关于NOTCH信号途径相关蛋白NUMBL,我们通过酵母双杂交技术筛选到两个蛋白可以与NUMBL发生相互作用的蛋白:SIAHl和TAB2。 围绕这两对蛋白质互作对,我们开展了两部分工作: 第一部分是NUMBL与SIAH1相互作用的研究; 第二部分是NUMBL抑制NF-kB信号通路的分子机制的研究。 在第一部分中,我们以NuMBL、SIAH1蛋白质相互作用对为研究对象,探讨了NUMB、NUMBL以及SIAHI三者的关系。首先,GST pull-down和免疫共沉淀实验证实NUMBL能够与SIAH1发生直接相互作用,并且NUMBL与SIAH1的底物结合区结合,共定位实验显示两者能够共定位于细胞质中。共转染实验证实NUMBL蛋白质水平不受SIAH1的影响,不能被SIAHl经泛素-蛋白酶体途径降解。NUMB是NUMBL同源蛋白,也是SIAH1泛素化降解的底物之一。我们发现NUMBL可以抑制SIAH1对NUMB的降解,稳定了NUMB的蛋白质水平,并且体内泛素化实验证实NUMBL削弱了SIAH1泛素化NUMB。 在第二部分中,首先通过转录激活实验证实NUMBL能抑制IL-1β及TNF-a诱导的NF-kB信号的激活,也能抑制TAB2及TRAF6引发的NF-kB信号的激活,并且稳定转染GFP-NUMBL的HEK293株对TNF-a的刺激不敏感。过表达实验表明NUMBL可以促进TRAF5、TRAF6蛋白质水平下降,但不影响TRAF5、TRAF6的mRNA水平转录。NUMBL可以与TRAF5、TRAF6在HEK293细胞中免疫共沉淀,但不能与TRAF2蛋白免疫共沉淀。GST pull-down实验证明NUMBL在可以与TRAF5、TRAF6、RIP在体外直接互作,共定位实验也证实NUMBL与TRAF5、TRAF6、RIP能在哺乳动物细胞中共定位于细胞质。 我们着重研究了NUMBL与TRAF6这对互作对,发现TRAF6的锌指结构域和TRAF结构域负责与NUMBL结合,而NUMBL的C端结构域能与TRAF6相互作用,PTB结构域对于与TRAF6的结合不是必需的。我们在实验中发现NUMBL会促进TRAF6降解,因此我们着重探讨了NUMBL对TRAF6泛素化的影响:在体内实验中,NUMBL对TRAF6总的泛素化水平以及以K63方式连接的多聚泛素化没有明显影响,但能增强TRAF6以K48方式连接的多聚泛素化。我们进一步的实验发现TRAF6的锌指基序(111-349aa)可能是发生以K48方式连接多聚泛素化的区域。 总结我们的工作可以归纳为两点:NUMBL不是SIAH1的泛素化降解底物,但可以抑制SIAHl泛素化降解NUMB;NUMBL通过与TAB2、TRAF6的互作,促进TRAF6蛋白降解,负调节NF-kB信号通路。NUMBL作为NUMB的同源蛋白,在神经皮层发育分化过程互补NUMB的功能,除此之外对于NUMBL功能的知之甚少。我们试图从与NUMBL相互作用蛋白的角度出发,在NUMB泛素化降解过程和负调节NF-kB信号通路方面,提出了NUMBL新的功能解释,为后续工作奠定了基础。