乙醇酸氧化酶(Glycolate oxdase，简称GLO)是光呼吸代谢的关键酶，生物信息学分析预测，在水稻基因组中一共有5条GLO的相似序列，分别在第三、四和第七染色体上。本实验室在前期研究中发现，四号染色体上的GLO-3(Os04g0623500)受多种非生物胁迫诱导表达。因此，深入探讨GLO-3的功能及其机理，可望为了解植物适应逆境胁迫的分子机理提供新的线索。本文采用RNAi和超表达技术，从转录水平调控GLO-3的表达，为全面分析GLO-3的生物学功能奠定基础。获得主要结果如下： 1.超表达和特异干涉GLO-3转基因植株的构建 从水稻根中提取总RNA，根据GLO-3的基因序列设计特异引物，通过RT-PCR从水稻的eDNA中扩增得到GLO-3干涉和超表达片段。将片段插入到组成型pYLRNAi表达载体中，构建组成型干涉和超表达载体并转化水稻，经PCR和Southern杂交检测，确定目的片断已经整合到了水稻基因组中。 2.GLO-3多克隆抗体的制备 从水稻的eDNA中扩增出GLO-3的ORF，将扩增的片段重组到pET30a载体，然后转化到大肠杆菌中，经IPTG诱导3小时后获得了大量目的蛋白。使用SDS-PAGE对目的蛋白进行纯化后用于免疫家兔。经三次加强免疫后获得了抗GLO-3的多克隆抗体。所获得的抗血清能较专一识别菌液中合成的GLO-3蛋白。 3.转基因植株的鉴定 因发现GLO-3并没有乙醇酸氧化酶活性，所以不能用酶活筛选出有效果的转基因植株；用Western Blot在根中同样也杂不到相应的GLO-3蛋白。因此本实验采用了半定量RT-PCR方法，测定了GLO-3在mRNA水平上的表达。由此筛选出了干涉效果理想的转基因植株，并证明可以用水稻的叶代替根做半定量进一步筛选，解决了用根做材料取材难的问题。 4.GLO-3与乙醇酸氧化酶活性的关系 测定了野生型和高下调比例的干涉植株叶中乙醇酸氧化酶活性，发现干涉植株叶中GLO活性并无明显降低，表明GLO-3可能不参与叶中乙醇酸氧化酶活性分子的构成或并非其催化活性所必需。 5.GLO-3蛋白表达检测 以所制备的抗体进行Western杂交分析，结果表明：正常培养条件下的水稻根中杂不到相应条带。以Al胁迫处理，相应位置的蛋白条带也没有被诱导上调，但在80kD左右出现了一条被强烈诱导上调的蛋白带，进一步用2-DE证明此蛋白的PI大约为7左右。水稻根中可能未产生GLO-3蛋白或出现了翻译后的修饰使蛋自的大小发生了变化。