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假臭草（Praxelis clematidea）是一种恶性入侵杂草，目前广泛分布于我国华南地区，对入侵生境生物多样性造成了重大危害。本研究采用ITS（InternalTranscribed Spacer）序列、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）和EST-SSRs（Express Sequence Tags-Simple Sequence Repeats）分子标记，从分子水平揭示假臭草快速扩散和入侵机理，研究其遗传多样性和遗传结构。研究内容及结果如下：以‘ITS4’和‘ITS5’为引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。序列拼接上传后，获得54个GeneBank登录号。经序列分析，发现12个单倍型(H1-H12)，H10单倍型存在于12个假臭草居群中，推测为祖先单倍型。基于MP法构建的单倍型进化树中，H9单倍型以较大的支持率（86%）单独聚一枝，其他单倍型聚成平行枝，说明种下分化不明显。分子差异性分析（AMOVA）结果表明，居群间的遗传变异水平（-4.57％）和遗传分化低（GST=-0.061，FST=-0.04569，NST=-0.031），居群内遗传变异水平高（104.57），遗传变异主要存在于居群内。错配分析表明，假臭草的分布符合快速扩张模型。由于NCBI的dbEST数据库中没有公布假臭草EST序列（截止2012年12月），根据EST-SSRs标记高保守和通用性特征，下载了假臭草同族植物甜叶菊（Stievia rebaudiana）、薇甘菊（Mikania micrantha）和胜红蓟（Ageratumconyzoides）的EST序列。共筛选出145个EST-SSR位点序列，其中，三核苷酸和六核苷酸重复基元出现频率最高，分别为37.24%、40.69%，四核苷酸重复基元最低为2.07%，其中，（AT）n在基元类型中出现频率最高（32%），（ACC/GAA）n次之（18.52%）。针对146个EST-SSR位点，本研究首次合成了27对EST-SSRs引物。结合单因素和正交设计试验，建立了假臭草EST-SSRs最佳PCR反应体系，即20μLPCR反应体系中，Mg2+浓度为2.75mmol·L-1，模板DNA用量为35ng，Taq DNA聚合酶为2.25U，dNTPs浓度为0.3mmol·L-1，引物浓度为0.6μmol·L-1。以优化体系进行引物筛选，27对EST-SSRs引物中，18对引物能成功扩增，占总引物的66.67%，其中7对引物具有较好的多态性，占可扩增引物的25.93%。序列分析显示，假臭草EST-SSRs标记在核酸水平上的多态性表现为基因序列的删除、单个或多个碱基序列的插入、SSR基元重复次数的改变和碱基倒置。EST-SSRs标记结果显示：来源于海南、广东和福建15个不同市假臭草居群间的遗传距离范围为0.0173（广东湛江和福建泉州居群）~0.2223（海南儋州和福建晋江居群），经Mantel检验，居群间的遗传距离和地理位置呈极低的正相关性，但达到极显著性水平(r=0.4315，P<0.01)；与薇甘菊相比（H=0.1849，I=0.2818），假臭草在物种水平上具有较高的遗传多样性（H=0.2439，I=0.3914）；居群间的遗传变异（31.43%）小于居群内的遗传变异（68.57%），遗传变异主要存在于居群内；主成分分析（PCA）表明假臭草可分为四组，I组为海南地区假臭草，II组主要为海南和广东地区假臭草，III组为福建和广东地区假臭草，第IV组主要为福建地区假臭草；基于遗传一致度的UPGMA法进行聚类分析，可将四组分为2大类：II组、III组和IV组为一类，I组独为一类，与其他三组分开表现出较大的遗传差异；基于遗传一致度进行UPGMA法聚类分析，假臭草15个自然居群可以分为4大类：第I类群包括HHK（海南海口）和HDZ（海南儋州）假臭草居群；第II类包括HWN（海南万宁）和HWC（海南文昌）假臭草居群；第III类包括HSY（海南三亚）、GZH（广东珠海）、GZJ（广东湛江）、FQZ（福建泉州）、GCZ（广东潮州）、FXM（福建厦门）、GHY（广东河源）、FFD（福建福鼎）和HQZ（海南琼中）假臭草居群，第IV类包括FJJ（福建晋江）和FFZ（福建福州）假臭草居群。假臭草ISSR标记分析，来自于海南、广东和福建三省15个不同市的假臭草居群间的遗传距离范围为0.0040（广东潮州和广东湛江居群）~0.2566（福建福州和广东河源居群），Mantel检验居群间遗传距离和地理位置呈极低的正相关性，但达到显著性水平（r=0.2935，p=<0.05）；居群间的遗传变异（35.50%）小于居群内的遗传变异（64.50%）；主成分分析（PCA）表明假臭草可以分为四组，I组包括大部分福建地区、部分广东地区和少部分海南地区假臭草，II组主要为海南地区的假臭草，III组主要为广东居假臭草，IV组全为福建地区假臭草，基于遗传一致度进行UPGMA法聚类分析，可将四组分为2大类：I、II和III组为一类，IV组独聚一类，与其他三组分开表现出较大的遗传差异；基于遗传一致度进行UPGMA法聚类分析，假臭草15个自然居群可以分为3大类：第I类包括FXM、FQZ、GZJ、GCZ、HSY、FJJ、FFD、GHY和GZH假臭草居群，第II类全为海南地区假臭草，包括HWN、HWC、HQZ、HHK和HDZ假臭草居群，第III类为FFZ假臭草居群，与其它14个假臭草居群分开；假臭草遗传多样性丰富（H=0.2519，I=0.3905），较高的遗传多样性是其生物入侵的一种手段。ITS序列、ISSR和EST-SSRs标记结果显示，假臭草居群间基因交流频繁（Nm>1），阻止了遗传漂变对遗传结构的影响；居群间的遗传变异小于居群内的遗传变异，遗传变异主要存在于居群内。EST-SSRs和ISSR标记UPGMA法聚类分析和主成分分析显示，海南地区假臭草聚类在一起，推断海南居群存在独立进化，这与海南独特的地理位置和各样的气候环境有关。另外，聚类图中显示，部分假臭草居群混杂聚在一起，这可能与人为因素的传播有关。EST-SSRs标记分析的遗传变异（Ht=0.2603，Hs=0.1785）大于ISSR标记分析（Ht=0.2572，Hs=0.1659），可能与环境选择压力不同有关。EST-SSRs扩增片段的测序结果反过来论证了本研究开发的EST-SSRs标记的有效性，并支持了该标记的特异性和通用性。本研究结果表明：EST-SSRs和ISSR标记研究假臭草遗传多样性是可行的。本研究表明，假臭草居群符合快速扩张模型，具有较高的遗传多样性，人为因素促进了假臭草的扩散和再次入侵。因此我们应采取相应的防除措施：国内质检部门应加强预防和监管工作，切断假臭草的传播途径；及时做出预警宣传，提高民众的公共预防意识。