论文部分内容阅读
肾脏中肾小管和集合管对水的重吸收决定着机体的水平衡,而肾小管的小管液中溶质所形成的渗透压,是对抗水重吸收的力量。因此,肾脏对水和电解质的重吸收和排泄是相互影响的过程,它们的平衡决定着肾脏功能的正常发挥。由于近端小管对水的重吸收是定比重吸收,而远曲小管和集合管对水的重吸收是可调节的,该部位对水和电解质的重吸收和排泄对机体的水平衡发挥着决定性作用,因此其调节机制具有重要的意义。肌动蛋白细胞骨架可以调控细胞形状、细胞运动等细胞过程。有文献表明,肌动蛋白及其相关蛋白参与肾脏的水盐代谢等各种功能的调节。在对血管加压素处理的小鼠皮质集合管顶端膜进行的蛋白质组学分析中,人们发现约100种蛋白发生显著变化,其中20%与肌动蛋白细胞骨架结构有关,这突出了肌动蛋白细胞骨架在调节水平衡中的重要作用。我们的前期研究发现,肌动蛋白微丝（actin filament,F-actin）的一个盖帽蛋白--原肌球调节蛋白1（Tropomodulin1,Tmod1）在肾脏远曲小管和集合管中特异表达,但其作用还有待研究。目的:通过研究Tmod1肾脏特异性敲除对小鼠肾脏水重吸收功能的影响,分析肾脏中与Tmod1相关的蛋白调控网络,研究Tmod1对水通道蛋白及离子通道的影响,探讨Tmod1对机体水平衡的调节及其作用机制。方法:1.利用免疫组化,确定Tmod1在小鼠肾脏中的表达和定位。2.构建Tmod1 flox/flox小鼠,并将其与肾小管和集合管特异表达Cre基因的Ksp-Cre小鼠杂交,获得Tmod1肾脏特异性敲除小鼠Tmod1 flox/flox/Ksp-Cre+（简称为TFK）,用Tmod1 flox/flox/Ksp-Cre-（简称为TF）小鼠作为对照。利用PCR和蛋白免疫印迹对小鼠进行鉴定。3.利用代谢笼测量并比较TF和TFK小鼠在基础状态、禁水和水负荷条件下的尿量、尿渗透压;利用无创血压测定仪测量两种小鼠的血压;利用生化分析,检测尿液中的离子浓度,计算电解质的排泄量。4.利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测TF和TFK小鼠血液中血管升压素（AVP）的含量;向两种小鼠腹腔注射AVP,收集并测量2小时后的尿量和尿渗透压。5.分离TF和TFK小鼠的肾脏组织并提取蛋白,将其进行质谱蛋白质组学分析。对差异蛋白进行生物信息学分析,并对部分蛋白的表达进行验证。6.利用实时定量PCR和免疫印迹,检测TF和TFK小鼠肾脏中水通道和离子通道表达。结果:1.免疫组化结果显示,Tmod1在肾脏远曲小管和集合管表达。2.PCR和蛋白免疫印迹结果显示,TFK小鼠的肾小管和集合管中Tmod1被敲除。3.代谢笼结果显示,在基础状态下,TFK小鼠24小时尿量为0.81±0.14mL,显著低于TF小鼠（1.59±0.12 mL,P<0.01）;其尿液渗透压为5494±259 mOsm/kg,显著高于TF小鼠的尿渗透压（3843±106mOsm/kg,P<0.01）。在禁水条件下,TFK小鼠的尿量为0.40±0.10 ml,亦明显低于TF小鼠（0.93±0.18mL,P<0.05）;TFK小鼠的尿渗透压为6512±977 mOsm/kg,显著高于TF小鼠的尿渗透压（3709±319mOsm/kg,P<0.05）。在水负荷24小时的条件下,TFK小鼠尿量为8.50±0.85 mL,显著低于TF小鼠（10.92±0.45 mL,P<0.05）,其尿渗透压为878±145 mOsm/kg,显著高于TF小鼠（492±16 mOsm/kg,P<0.05）。血压测量结果提示,TFK小鼠的收缩压为97.9±0.8 mmHg,显著高于TF小鼠（105.0±1.6 mmHg,P<0.05）。4.TFK小鼠在基础状态下24小时内,主要电解质(包括Na+、K+、Cl-、Ca2+、P)和尿素的排泄量均较TF小鼠降低（P<0.05）。5.ELISA检测显示,TFK小鼠血液中血管加压素水平与TF小鼠无差异;两种小鼠在注射AVP后,尿量均减少,尿渗透压均升高。6.质谱分析结果显示,与TF小鼠肾脏相比,在TFK小鼠肾脏中有83个差异表达（变化倍数>2或<0.5,P<0.05）蛋白,其中13个上调,70个下调。Gene Ontology分析显示,差异表达基因与蛋白磷酸化、代谢过程、磷酸化过程和细胞内信号转导等生物过程有关,还与细胞外泌体、线粒体、溶酶体等细胞成分有关。7.蛋白免疫印迹实验显示,所筛选出的TGFβR2、SlC25A11和MTFP1等蛋白均在TFK小鼠肾脏中表达下调。8.qPCR和蛋白免疫印迹结果显示,与TF小鼠肾脏相比,TFK小鼠肾脏中AQP2、AQP4和氯离子通道CFTR的表达均显著上调。结论:Tmod1的敲除能够引起小鼠尿浓缩能力的改变,使小鼠表现出少尿、高渗尿和高血压的特征,肾脏中Tmod1可以影响多种蛋白的表达,参与调节肾脏的多种生物过程,特别是通过对水通道及离子通道的调节,进而影响机体的水平衡稳态。