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目的:探讨二氧化硒(SeO2)对宫颈癌细胞凋亡的诱导作用及其表观调控机制,明确硒化合物抗肿瘤作用的机制,为其作为抗癌药物的开发提供实验依据。方法:1.细胞培养与分组:选择不同HPV亚型宫颈癌细胞株Hela细胞、Caski细胞作为实验对象,用含10%FBS的RPMI1640培养基常规培养细胞,置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养至对数期,随机分为实验组和空白对照组。实验组予不同浓度SeO2(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)处理24h,空白对照组予无血清培养基。根据待测指标需要取样待测。2.指标检测:倒置光学显微镜下观察不同组两株细胞株经过SeO2处理后的形态学变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测SeO2对细胞增殖及活力的影响;利用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;用Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3、P53蛋白表达的水平;Step-loop实时定量PCR检测细胞内凋亡相关microRNA(miRNA) let-7a的表达水平。结果:1.形态学观察:倒置光学显微镜下可见,SeO2对体外培养的宫颈癌细胞株生长形态均产生明显影响。与对照组细胞相比,细胞变圆皱缩,胞内颗粒增多,失去正常形态,贴壁细胞减少,增殖减慢;随着SeO2作用浓度的提高,细胞密度逐渐降低,细胞间间隙逐步增大,呈剂量依赖性。2.细胞增殖活力分析:采用MTT法检测SeO2对不同宫颈癌细胞株抑制作用,结果示SeO2对宫颈癌细胞株的抑制作用呈量效依赖关系,Hela细胞各实验组(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)细胞抑制率分别为1.22%、20.25%、35.03%、43.56%、60.74%,其中7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L浓度组与对照组差异显著(P<0.05);SeO2对Caski细胞的抑制作用随药物浓度的升高亦呈明显上升趋势,各实验组(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)细胞抑制率分别为14.39%、34.08%、43.01%、57.73%、68.65%,与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。3.凋亡检测:运用流式细胞术检测不同浓度SeO2对宫颈癌细胞株的凋亡诱导作用。随着SeO2药物浓度的升高,诱导作用逐渐增强,呈浓度依赖性。0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L浓度SeO2诱导Hela细胞凋亡率分别为3.12%、30.56%、33.42%、37.50%、45.43%、69.38%,0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L浓度SeO2诱导Caski细胞凋亡率分别为3.7%、10.7%、67.5%、78.2%、87.1%、85.2%,凋亡率均随药物浓度增加呈上升趋势。4. Caspase-3、P53蛋白表达水平测定:采用Western blot技术分析不同细胞组凋亡相关蛋白表达水平,结果显示SeO2可明显上调宫颈癌细胞株中Caspase-3与P53蛋白水平。对Hela细胞的Caspase-3、P53蛋白表达上调作用于7.5μmol/L处达到峰值,各实验组较空白组均有显著差异(P<0.05)。Caski细胞中低浓度组Caspase-3蛋白诱导作用不明显,至7.5μmol/L、15μmol/L及30μmol/L浓度蛋白表达量较空白组有显著差异(P<0.05)。各实验组对P53蛋白水平的诱导作用较空白组均有显著差异(P<0.05)。5. Let-7a表达水平分析:Step-loop实时定量PCR检测不同组宫颈癌细胞株凋亡相关miRNA let-7a表达,结果表明实验组细胞let-7a表达水平显著提高,在7.5μmol/L处出现峰值,-⊿⊿Ct分别为7.79(Hela细胞)和14.06(Caski细胞)。结论: SeO2上调宫颈癌细胞中凋亡相关蛋白P53蛋白及miRNA let-7a的表达,经Caspase-3途径诱导细胞凋亡。