淀粉是由葡萄糖单体单元以糖苦键连接而成的高聚物,是地球上含量最为丰富的聚合物之一。根据糖苷键的区别,淀粉包含两种重要组分:直链淀粉(线性α-1,4-键连接的葡聚糖)和支链淀粉(线性α-1,4-键连接的葡聚糖上连有α-1,6-键的支链),使得淀粉糖链形成分支结构。由于淀粉其结构的复杂性,单一酶类难以将其彻底的水解,因此在淀粉处理过程中通常需要淀粉酶和脱支酶等在内的多种酶协同作用。异淀粉酶(EC 3.2.1.68)是2种主要的淀粉脱支酶的一种,特异性的水解分支点的α-1,6-糖苷键,对糖原,支链淀粉以及极限糊精中的α-1,6-糖苷键具有不同程度的水解作用。异淀粉酶在淀粉深加工工业具有重要的价值,常通过与α-1,4-淀粉酶、糖化酶等配合使用来生产葡萄糖、麦芽糖、部分麦芽寡糖、环糊精以及抗性淀粉等产品,能够显著提高淀粉的转化效率。本研究通过底物吸附的手段从珊瑚球菌属Corallococcus sp.EGB的胞外上清中分离纯化得到一个能够特异性水解α-1,6-糖苷键的淀粉酶,命名为IsoM。通过肽指纹图谱鉴定并结合Corallococcus coralloides 2259基因组序列,得到了编码该淀粉酶的基因序列。序列分析发现isoM编码异淀粉酶,与已知功能性验证的其他异淀粉酶同源性不高,遂对其进行外源表达酶学性质和功能挖掘等方面研究。利用毕赤酵母Pichiapastosts GS115真核表达系统实现该基因的异源表达。对其酶学性质进行研究,该酶最适温度为45°C,最适pH值为6.0,比活为70600 U/mg(碘液法),底物谱分析发现,该酶对土豆淀粉展现出最高活性,对普鲁兰多糖活性弱,对直连淀粉没有活性,证明IsoM为专一水解α-1,6-糖苷键且对α-1,4-糖苷键无水解作用的典型的异淀粉酶。选取甲醇添加量、装液量、发酵液pH、诱导时间和接种量五个单因素中选取影响较大的三个因素进行正交试验,初步确定该酶的最适发酵条件为pH 6.0,接菌量为8%,甲醇添加量0.8%。利用本实验室构建的marker回收系统,共表达HAC1、YDJ1、ERO1、PDI和BIP五种分子伴侣,发现共表达HAC1使该酶产量提高110%。为了研究IsoM的作用方式,对IsoM水解后的固体残余物进行SEM观察,结果发现淀粉颗粒内部随作用时间出现孔洞与皱褶,并出现裂痕,说明该酶作用于淀粉颗粒内部,由内而外瓦解淀粉颗粒,最终形成具有规则晶体结构的抗性淀粉而不再水解。于此同时,还探究了 IsoM对于支链长度的偏好性,通过HPAEC分析,发现随作用时间的延长,水解产物中低DP值糖链含量与高DP值糖链含量的比值逐渐下降,以上结果表明,该酶对短支链具有偏好性,优先水解短支链脱支,而后水解长支链脱支。基于异淀粉酶IsoM良好的酶学特性,本研究对其应用前景进行初步的探究。我们发现IsoM能提高慢消化淀粉(SDS)与抗性淀粉(RS)的产量,而这两种淀粉在食品与医药领域具有重要的应用价值。rIsoM 水解产生70.9%的抗性淀粉与9.2%的慢消化淀粉,与商业化普鲁兰酶(Promozyme(?)D2)相比,两者抗性淀粉产量相当,慢消化淀粉产量提高16.5%。故该酶在食品与药品添加剂方面有重要工业潜在价值。异淀粉酶在实际应用过程中常与其他淀粉酶类进行联合水解,本研究以本实验室之前研究的麦芽六糖淀粉酶AmyM为联合对象,研究IsoM对麦芽寡糖的产生的影响。研究发现相对于rAmyM单独水解作用,联合水解可提高六糖产量60%。以上研究结果表明IsoM在淀粉加工等工业领域有潜在的应用价值。