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背景破骨细胞是负责骨吸收的主要功能细胞,在维持骨代谢平衡中起着关键作用。破骨细胞分化增加及其骨吸收功能增强,易引发骨质疏松。晚期氧化蛋白产物(Advance oxidation protein produces,AOPPs)是体内蛋白质在氧化应激状态下氧化生成的一类双酪氨酸蛋白质交联物,也是一类致病介质,参与多种疾病的发生发展。我们的前期研究证实:绝经后骨质疏松患者体内AOPPs升高,血清AOPPs蓄积水平与腰椎骨密度呈负相关关系,且血清TRAPa水平升高,提示破骨细胞活性增强;AOPPs体内干预可加速老龄大鼠骨量丢失、骨微结构退化,增强氧化应激水平;AOPPs体外干预可抑制成骨样细胞增殖、降低成骨分化活性。但是,迄今为止,AOPPs对破骨细胞分化及骨吸收的影响尚不清楚。目的本研究拟探讨AOPPs对破骨细胞分化和骨吸收的作用及其分子机制。方法本研究以大鼠骨髓单核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMs)为主要体外研究模型,并用AOPPs干预,做以下检测:1.抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-rsistant acid phosphatase,TRAP)染色,评价 TRAP 染色阳性多核破骨细胞形成;2.检测TRAP酶活性;3.Real-time PCR检测破骨细胞分化相关基因表达变化;4.罗丹明-鬼笔环肽荧光染色,评价F-actin环形成;5.骨吸收陷窝形成分析;6.DCFH-DA探针检测细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成;7.免疫印迹法检测NADPH氧化酶相关亚基和NFATc1的表达,检测MAPK相关亚基和c-fos磷酸化程度变化。大鼠颅骨骨膜下重复定点注射AOPPs为体外研究模型,9天后做以下检测:1.Micro CT三维重建各组干预后的颅骨,并评价骨吸收陷窝的形成情况;2.TRAP染色检测TRAP染色阳性多核破骨细胞形成。结果1.AOPPs诱导破骨细胞分化和骨吸收的作用:(1)BMMs经过AOPPs诱导,导致TRAP 阳性多核细胞生成,增加TRAP酶活性;诱导破骨相关基因(如TRAP,MMP9,Cathepsin K和Oscar)表达;(2)AOPPs激活破骨细胞分化相关转录因子c-fos和NFATc1;(3)BMMs经过AOPPs诱导,导致F-actin环和骨吸收陷窝形成;(4)大鼠颅骨骨膜下注射AOPPs,可诱导破骨细胞分化及骨吸收作用。2.AOPPs诱导破骨细胞分化和骨吸收的分子机制:(1)AOPPs干预增加BMMs胞内ROS水平;(2)AOPPs通过NADPH氧化酶途径促进ROS生成AOPPs干预后,可增加BMMs细胞内ROS生成。NADPH氧化酶的特异性抑制剂Apocynin和ROS清除剂SOD能阻断该效应。此外,上述干预后,NADPH氧化酶相关亚基表达量增加,如NOX1,NOX4,P22phox和P47phox;(3)AOPPs激活MAPKs信号通路AOPPs干预后,JNK,ERK和P38的磷酸化均有不同程度的增加,并呈现出时间依赖性。预处理NADPH氧化酶抑制剂Apocynin和ROS清除剂SOD后,AOPPs干预细胞,JNK,ERK和P38的磷酸化过程均能不同程度被抑制。其中,SOD抑制效应最明显;(4)AOPPs激活破骨相关转录因子c-fos和NFATc1AOPPs干预后,c-fos的磷酸化增加,NFATc1表达增加。预处理NADPH氧化酶抑制剂Apocynin、ROS清除剂SOD、JNK特异性抑制剂SP600125、ERK特异性抑制剂U0126和P38特异性抑制剂SB203580后,100μg/mLAOPPs干预细胞,c-fos的磷酸化过程均能不同程度被抑制。NFATc1可见类似的效应;(5)AOPPs通过NADPH氧化酶/ROS/MAPKs敏感信号通路诱导破骨细胞分化和骨吸收作用预处理NADPH氧化酶抑制剂Apocynin、ROS清除剂SOD、JNK特异性抑制剂SP600125、ERK特异性抑制剂U0126和P38特异性抑制剂SB203580后,100μg/mLAOPPs干预细胞,TRAP染色阳性多核细胞、TRAP活性试验、F-actin环、破骨细胞相关基因表达、骨片吸收实验均能不同程度被抑制。结论1.AOPPs可诱导破骨细胞分化和骨吸收作用;2.AOPPs通过NADPH氧化酶/ROS/MAPK敏感通路促进破骨细胞分化和骨吸收。