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我国是水禽养殖大国,水禽养殖业成为我国的特色产业,我国水禽饲养量居世界首位,年出栏量约60亿只,占世界总量的80%左右。对水禽肉、蛋旺盛的消费市场需求催生了水禽养殖业的加速投产,水禽产业发展迅速。山东地区有良好的饲养传统和优良的气候环境,水禽产业养殖规模稳居全国之首,并快速实现了产业化发展,聊城地区水系发达,是山东省主要的水禽养殖集散地。基于本实验室近年来对山东地区的水禽样本进行的调查统计显示,规模化养殖场内水禽病毒病的频发,是制约水禽养殖业的重要原因。根据已有病毒样本的调查得知,当前危害聊城地区水禽行业疫病的主要病原有禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、禽坦布苏病毒（Avian Tambusu virus,ATMUV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）、禽星状病毒（Avian Astrovirus,AAst V）、鸭细小病毒（Duck parvovirus,DPV）等,为了明确这6种病毒病的流行趋势展开调查。结合已有研究发现该地区NDV的弱毒感染率较高,分析原因可能是NDV活疫苗普遍接种导致的,所以很难通过对免疫禽的检测来区分疫苗和野毒感染。本研究以决定NDV病毒毒力的主要蛋白F为切入点,基于F基因的特性建立了NDV强毒特异性的反转录荧光定量PCR检测方法。此外,DPV感染引起生长抑制,僵鸭淘汰率高,给养殖业带来巨大的经济损失。本研究对DPV进行基因组测序,明确其遗传演化规律,可加快鉴定DPV毒株的进程。通过以上研究丰富了水禽病毒病的分子流行病学调查数据,为病毒病的预警提供数据支撑,为防控与净化提供理论依据。研究内容如下:1、水禽重要病毒病的流行病学调查为了解这6种病毒感染在该地区的流行情况,本研究于2018～2022年间在聊城地区的主要的规模化养殖场采集病料540份,并对其进行流行病学调查。结果表明采集的540份样品中,AIV、ATMUV、NDV、DHAV、AAst V和DPV感染率分别为31.67%、14.63%、14.44%、10.74%、4.44%和2.96%;以单一病毒感染为主,AIV的HA分型结果显示,低致病性的H9亚型AIV仍是流行最广的分型,进一步分型明确该地区主要流行H9N2型AIV;具有一定比例的混合病毒感染,且以NDV-AIV双重感染占比最高;病毒感染具有明显的季节特征,冬春季节流行。2、新城疫强毒RT-qPCR检测方法的建立NDV毒力的强弱与F蛋白裂解位点区的氨基酸序列密切相关,因此氨基酸序列上的差异也成为基因水平上区分NDV强、弱毒株的靶点。基于F基因的基因组特点构建了NDV强毒RT-qPCR检测方法。优化反应条件,经验证当退火温度为55℃、引物浓度为10μM/L时体系的扩增效率最佳,且在该反应条件下溶解曲线单一;该方法的检测下限值为1拷贝/μL;其仅能特异性扩增强毒,对弱毒株和其他毒株并无扩增。3、鸭细小病毒的分离鉴定及全基因测序对PCR检测的细小病毒阳性病料进行病毒的分离鉴定,获得五株鸭源细小病毒SD187、SD271、SD272、SD274和SD278;对5株毒株进行基因组测序,证实在NS蛋白和VP蛋白上均存在3个潜在的糖基化位点;经遗传进化分析、VP基因和NS基因的核苷酸和氨基酸同源性分析得知,获得的毒株均属于DPV分支且高度同源。综上所述,AIV、ATMUV、NDV、DHAV、AAst V和DPV在山东部分地区的养殖场中普遍存在,存在一定的季节规律,是造成我国山东地区规模化水禽养殖场疫病防控复杂化的重要原因;本研究建立了NDV的快速、低成本使用的RT-qPCR检测方法仅能特异性扩增强毒,最低检测浓度为1拷贝/u L;成功分离鉴定5株DPV毒株,基因组序列分析显示具有99%以上的同源性,为山东省主要的DPV流行株。本研究通过对聊城地区采集的水禽样本进行调查,了解6种水禽源病毒感染在聊城地区的流行趋势,进而为山东省乃至全国范围内的水禽病毒感染调研情况提供数据参考,为水禽疫病防控体系构建提供理论指导。通过构建新城疫强毒RT-qPCR检测方法,区分强弱毒株感染,排除疫苗干扰,为NDV的检测提供预警信息,对NDV强毒感染的发生和疫情蔓延进行有效控制;对DPV进行基因组测序,了解毒株的遗传进化特性,为细小病毒疫苗的研发、细小病毒病的有效防控和净化提供理论基础,进而为实现水禽养殖业健康可持续发展提供技术支撑。