论文部分内容阅读
常规的癌症化疗干预易导致药物分子的全身分布,进而对人体正常组织产生强烈的毒副作用。靶向药物递送系统可将药物分子特异性的递送至肿瘤部位,减少药物分子在正常组织器官中的泄露,降低毒副作用,增强治疗效果。肿瘤微环境（TEM）为肿瘤的生长提供良好且复杂的生存环境,有利于肿瘤的生长、侵袭及转移。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一类在肿瘤微环境中高表达,在正常组织中微弱表达的蛋白酶。因此,基质金属蛋白酶作为药物递送的靶点,被广泛应用于智能药物递送系统。致孔肽（pore-forming peptide,PFPep）具有α-螺旋结构,可通过疏水性相互作用与脂质自组装形成孔道,有利于药物通过孔道释放出来,产生作用。该多肽具有一段可被MMPs特异性识别并水解的氨基酸序列,因此具有MMPs敏感性。聚乙二醇（polyethylene glycols,PEG）修饰于脂质体表面。可堵塞致孔肽的孔道,亦可避免网状内皮系统（Reticuloendothelial system,RES）对载药系统的识别和清除,延长载药系统在体内的循环时间,有利于药物在肿瘤部位富集。本文将根据PFPep与PEG的特点,通过迈克尔加成反应将PEG连接到PFPep表面形成可被MMPs特异性识别切割的功能性聚合物（Enzyme-activated PEG-PFPep conjugate,PEG-P）。首先,以PEG-P、磷脂等为原料,通过薄膜分散-水化法制备空白脂质体,使用硫酸铵梯度法包载模型药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）,以粒径、多分散系数（polydispersity index,PDI）、电动电位（Zeta potential,Zeta）及包封率（encapsulation efficiency,EE）等参数为评价指标对脂质体进行表征。其次,构建体外三维（3D）肿瘤球模型考察脂质体渗透能力及酶敏感性释药能力。再次,采用皮下荷瘤裸鼠模型进行小动物活体成像,考察脂质体的体内分布情况。最后,采用原位荷瘤小鼠模型,进行抗肿瘤能力评价和初步毒性评价。第一部分酶敏感脂质体的制备和表征目的:制备普通阿霉素脂质体（LP-DOX）,PFPep和PEG共修饰的酶敏感阿霉素脂质体（PEG-P-LP-DOX和PEG-P-LP-DOX&Di D）和SCA&Di R脂质体（PEG-P-LP-SCA&Di R和LP-SCA&Di R）,并对制得的脂质体进行表征。方法:致孔肽中的巯基与PEG中的马来酰亚胺基团,通过迈克尔加成反应,合成功能性聚合物（PEG-P）。采用薄膜分散-水化法制备LP-DOX、PEG-P-LP-DOX和PEG-P-LP-DOX&Di D,乙醇注入法制备PEG-P-LP-SCA&Di R和LP-SCA&Di R。结果:脂质体粒径均一,且粒径均在100～200 nm范围内,PDI≤0.25,EE>90%。结论:本部分构建的脂质体,其粒径、电位和包封率等均符合标准,可用于后续实验。第二部分体外三维肿瘤球模型水平研究目的:通过观察脂质体进入三维细胞球的动态过程,评价脂质体的酶敏感性及肿瘤球渗透能力。方法:采用悬滴法构建体外HT-1080肿瘤球模型和MCF-7肿瘤球模型,激光共聚焦显微镜观察三维肿瘤球内DOX的渗透。结果:在MMPs存在的情况下,DOX可从PEG-P-LP-DOX&Di D脂质体中游离出来,渗透进入肿瘤球内部。结论:通过体外三维肿瘤球模型考察制剂的肿瘤球渗透能力及酶敏感性,结果表明,PEG-P-LP-DOX&Di D具有较强的酶敏感释药特性,且能渗透进入肿瘤球内部。第三部分酶敏感脂质体的体内分布评价目的:以皮下荷瘤裸鼠为模型,考察制剂在荷瘤小鼠体内的分布情况,评价制剂在荷瘤小鼠体内的靶向性蓄积能力。方法:构建MCF-7&HT-1080皮下荷瘤裸鼠模型,通过小动物活体成像仪观察PEG-P-LP-SCA&Di R在裸鼠体内的荧光分布,研究制剂的体内靶向性蓄积能力和酶敏感特性。结果:在皮下荷瘤裸鼠模型中,PEG-P-LP-SCA&Di R滞留在裸鼠肿瘤部位,且在HT-1080肿瘤部位呈现更好的酶敏释药特性;结论:通过MCF-7&HT-1080皮下荷瘤裸鼠模型,证实了本课题构建的酶敏感脂质体可在肿瘤部位富集,并在MMPs高表达的HT-1080肿瘤部位释放药物。第四部分酶敏感脂质体体内药效学与安全性初步评价目的:以4T1-luc原位荷瘤小鼠为模型,评价制剂抗肿瘤作用和抗转移能力。并对制剂进行初步毒性分析。方法:荷瘤小鼠经过尾静脉注射给药后,采用游标卡尺监测肿瘤体积变化,考察制剂的抗肿瘤增殖能力;通过对各组小鼠离体肺组织进行肿瘤结节计数,考察制剂的抗肿瘤转移能力;使用天平监测小鼠体重变化,进行血生化分析,各组织器官及肿瘤进行苏木精-伊红（H&E）染色分析,初步考察制剂毒性。结果:PEG-P-LP-DOX肿瘤抑制能力最强,能显著抑制小鼠肿瘤生长,有较少的肺转移,且对荷瘤小鼠正常组织器官未造成明显损伤。结论:本课题构建的酶敏感阿霉素脂质体PEG-P-LP-DOX可有效抑制小鼠原位肿瘤的生长,有较好的肿瘤增殖抑制能力,抗肿瘤转移能力,和显著降低的全身毒性。