目的：　　 原发或继发的视网膜神经细胞变性最终导致不可逆盲。这类疾病临床上目前尚无有效的治疗措施，因为神经元是不可再生的细胞。众多的实验方法中，细胞移植替代技术最有可能成为一种治疗神经元变性的有效途径。细胞替代治疗成功的首要前提是：有稳定的、免疫组织相容程度高的供体细胞。本论文旨在探讨鸡胚视网膜色素上皮细胞能否被活化型bHLH基因neurogenin1(ngn1)、ngn3和ash1在体外再程序化为视网膜神经元并且鉴定不同基因诱导的神经元类型。　　 方法：　　 neurogenin1(ngn1)，ngn3和ash1的全长mRNA序列克隆到逆转录病毒RCAS前病毒载体中，于鸡胚纤维母细胞中组装病毒，收集并提纯一定浓度的病毒颗粒。RCAS-GFP作为对照病毒。清洁级受精鸡蛋孵育到胚胎第2.5天(E2.5)时视网膜下分别显微注射携带三种基因病毒悬液。因RCAS在鸡胚体内可以整合到细胞中，并随细胞的分裂增殖得到扩散，所以发育中分裂旺盛的胚眼视网膜神经层和色素上皮可以被携带基因的病毒感染。病毒感染率通过对病毒蛋白P27的表达情况监测进行推测。注射后的鸡胚继续孵育到一定发育阶段(E6，E7.5或E12)时，RPE组织从胚眼中分离并平铺于Transwell()插入培养皿中体外培养一定时间。为了排除血清中的生长因子(如bFGF)对实验结果产生影响，一律采用含20％血清替代品的Knock-out DMEM细胞培养液。体外培养一段时间后，将RPE组织固定并以OCT/蔗糖混合物冷冻包埋，然后制作5-10μm的冰冻切片。常规荧光标记的免疫组织化学染色法及改良的原位杂交技术用于检测感染病毒的携带的三种基因能否将RPE细胞再程序化。此处指的改良原委杂交技术是指，常规原位杂交显色完成后加一步细胞脱色素的过程以利于原位杂交信号观察。实验中所用的视网膜感光细胞标记包括：视锥蛋白(visinin)：视锥细胞细胞内的一种钙结合蛋白；视红素、视紫红质，感光器间视黄醇类结合蛋白片段(IRBP)等视色素；光传导通路中涉及的a.转导蛋白(α-transducin，ALT)以及突触相关蛋白SNAP-25和PSD-95等。视网膜节细胞的标记蛋白包括RA4，Brn3A和3A10等。另外尚使用Calretinin识别水平细胞，双极细胞，无长突细胞和节细胞；LIM(4H6)识别水平细胞。通过研究RPE细胞本身特有的基因mmp115(115 kDa大小的melanosomal matrix protein)的表达水平，了解RPE过表达活化型bHLH基因后自身特质的改变。同时也检验了在眼部组织发育过程中起重要作用的基因Pax6和chx10的水平变化。RPE再程化过程中的细胞增值能力通过检查细胞整合bromodeoxyuridine(BrdU)的情况进行评价。在ngn1处理的RPE细胞内通过同时标记visinin和BrdU了解光感受器细胞生成过程是否伴随细胞增殖。　　 结果：　　 为使RPE组织可以有效的黏附在transwell()膜上，最早固定的一批标本为分离、培养后4小时，此时ngn3处理的RPE组织中有较多的visinin阳性细胞出现，ngn1处理者仅有极个别细胞为visinin阳性，而ash1处理的组织中未见神经元特意性蛋白表达。2-3天以后ngn1,ngn3处理的组织内均见到大量的visinin+细胞，个别部位夹杂RA4+，Calretinin+和H5+细胞。这些visinin+细胞在8DIV尤其是16DIV时表达诸多较成熟的感光细胞特有的标记基因：视红素，视紫红质IRBP和ALT以及突触相关蛋白SNAP-25和PSD-95。GFP对照组织中Pax6的表达较少，其在ngn1过表达组织中的特点为：visinin+细胞中的表达水平高，而visinin+细胞中Pax6表达明显减少。visinin+细胞中mmp115的表达量明显下调。另外，E18 RPE组织体外加入RCAS-ngn3后在15DIV同样有大量的visinin+细胞可以检测到。组织培养伊始加入BrdU，培养两天后，无论在对照组还是处理组，均可观察到有多数细胞整合BrdU。BrdU和visinin的双标记显示大部分visinin+细胞为两种分子双标记，有小部分细胞只表达visinin。RCAS-ash1可将RPE组织向不同的方向再程序化，子细胞表达多种蛋白：visinin，RA4，3A10，Brn3A，Calretinin和4H6。但即使在体外培养的第16天，visinin+细胞内未见有视红素等视色素表达。　　 结论：　　 RPE组织在体外可以旺盛增殖。RCAS-ngn1或ngn3过表达的情况下RPE组织丢掉了它们作为RPE自身的分子特征，大量细胞再程为视网膜感光细胞。新生成的感光细胞除表达钙结合蛋白外还表达功能必需蛋白视色素和光传导通路和突触相关蛋白，提示这些光感受器细胞逐渐走向成熟。RCAS-ash1可能诱导RPE向多种神经元发育途径分化，包括幼稚感光细胞，视网膜神经节细胞，水平细胞和无长突细胞。所有这些试验数据说明RPE细胞能够在一定条件下作为视网膜细胞替代治疗的供体细胞来源。