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研究背景及目的:放疗在前列腺癌治疗中占有重要地位,其杀伤肿瘤细胞的主要方式是引起肿瘤细胞DNA双链损伤,然而肿瘤细胞往往可以通过各种途径对损伤的DNA进行修复,使之对放射治疗产生耐受。针对这一难题,寻找合适的放疗增敏剂成为了前列腺癌研究的热点问题。本研究组一直着眼于前列腺癌放射增敏的研究,发现阻断EGFR(Epidermal growth factor receptor)或IGF1R(Insulin-like growth factor receptor1)的抑制剂能增加射线对前列腺癌细胞的敏感性,。但同时发现单一使用一种药物作为放疗增敏剂在临床上往往疗效有限。目前,有研究发现将两种或多种放疗增敏药物联合使用时,可能会出现药物间的协同效应,实现“1+1>2”的效应。Genistein具有多重抗前列腺癌的活性,本小组前期研究发现在膀胱癌中,Genistein可以抑制DNA损伤修复重建的关键性激酶ATM(ataxia-telangiectasia-mutated)的激活,抑制DNA损伤修复重建,促进细胞凋亡。同时Genistein还可以抑制EGFR等多种酪氨酸激酶的激活,杀灭导致放疗耐受的肿瘤干细胞等多种效应抑制肿瘤细胞的放射耐受。因此,Genistein对于其他放疗增敏剂可能是一种非常有用的辅助药物。因此本实验在我们前期研究的基础上,提出联合应用Genistein与IGF1R的抑制剂AG1024来提升前列腺癌的放疗效果。研究与单独运用一种放疗增敏剂相比,二者的联合使用是否会产生协同效应,并尝试从IGF1R信号通路、DNA损伤修复过程等多个不同层次阐明此种协同作用的机制,从而为临床前列腺癌的放疗增敏奠定理论基础。实验方法:1、放射剂量及药物浓度的设定:将前列腺癌细胞(PC-3、DU145)分别给予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、20 Gy剂量的X线照射,24小时后通过CCK-8实验检测各组细胞的存活率,进而摸索最合适的放射剂量作为后续研究剂量;将前列腺癌细胞分别用10μM、20μM、30μM、50μM、100μM的Genistein预处理1 h后,4 Gy的X线照射,24h后通过CCK-8实验检测细胞存活率,进而摸索最合适的Genistein浓度作为后续实验浓度。因前期研究已摸索出AG1024的理想实验浓度为10μM,因此本研究未再摸索AG1024实验浓度。2、细胞学实验:将实验分为4组分别为对照组、Genistein组、AG1024组和Genistein+AG1024组。将前列腺癌细胞分别用DMSO、Genistein、AG1024和Genistein+AG1024预处理1 h后置于4 Gy X线下照射。24h后分别通过CCK-8实验检测各组细胞存活率,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞技术检测细胞周期分布及凋亡情况。激光共聚焦检测γH2AX的焦点形成能力,Western-blot检测细胞凋亡及DNA修复关键基因的表达情况。3、动物学实验:利用前列腺癌DU145细胞于6-8周雄鼠裸鼠皮下荷瘤,20天后将小鼠随机分为四组,并分别给与DMSO、Genistein、AG1024和Genistein+AG1024的处理后,于X线下照射,处理每3天一次,共5次,并实时监测肿瘤体积及小鼠体重变化。结果:1、CCK-8实验结果显示单独Genistein处理时PC-3与DU145细胞在X线4Gy照射24 h后细胞存活率分别为(68.39±5.23)%和(65.38±3.67)%;单独AG1042处理时PC-3与DU145细胞细胞存活率分别为(55.72±4.75)%和(57.66±5.03)%,然而当两者联合使用时PC-3与DU145细胞存活率分别降为(35.33±4.67)%和(40.52±3.67)%,与仅加入DMSO的对照组向比差异具有统计学意义(P<0.05),联合使用组与单独使用Genistein或AG1024组比差异也具有统计学意义(P<0.05)。2、克隆形成实验结果显示,单独Genistein处理后PC-3和DU 145细胞的克隆形成率分别为(70.33±5.67)%和(67.48±4.08)%;单独AG1024处理后PC-3和DU 145细胞的克隆形成率分别为(55.62±4.63)%和(58.21±2.03)%;而当联合使用二者时PC-3和DU 145细胞细胞的克隆形成率分别降为(23.38±3.61)%和(28.34±4.28)%。与对照组相比P值均小于0.05,差异具有统计学意义。3、流式细胞术测细胞周期实验结果显示,PC-3细胞和DU 145细胞经Genistein预处理后,细胞周期明显阻滞于S期,而经AG1024处理后细胞周期阻滞于G2/M期,当联合使用时阻滞于S期的细胞比率明显提升。4、流式细胞术测凋亡实验结果显示单独使用DMSO处理时PC-3细胞和DU 145细胞经X线照射后的凋亡率仅为(3.25±0.64)%和(2.57±0.41)%,而使用Genistein预处理后,X线引起的PC-3细胞和DU 145细胞凋亡率分别增加为(7.38±1.05)%和(5.06±0.52)%;AG1024预处理后,X线引起的细胞凋亡率分别增加为(8.57±0.76)%和(5.24±0.18)%;二者联合处理时,X线引起的细胞凋亡率显著增加分别达到了(17.32±1.08)%和(15.32±0.84)%。5、Western-blot实验显示单独或联合使用Genistein、AG1024后给予X线照射,前列腺癌细胞的促凋亡因子Bax、acaspase-3表达量增加,而凋亡抑制因子Bcl-2表达量降低。6、激光共聚焦实验结果显示在仅加入DMSO预处理的对照组中,4Gy X线照射仅仅在PC3细胞和DU 145细胞中诱导出8.73±0.84和6.85±0.75个γH2AX焦点;Genistein预处理后,则分别达到了12.33±0.64和10.57±1.03个;AG1024处理后为14.68±0.84和10.84±0.95个;二者联合预处理后,γH2AX焦点明显增加分别达到了20.85±0.82和17.55±0.54个。与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。7、Western-blot实验显示单独或联合使用Genistein、AG1024后给予X线照,Genistein同时抑制前列腺癌细胞中Ra51及Ku70、DNAPKcs表达,而AG1024仅抑制Ku70、DNAPKc表达。8、动物学实验结果显示,裸鼠在经过了Genistin或AG1024处理后再用X线照射处理后肿瘤体积与对照组相比明显减小,且二者联合使用时体积减小更加明显,相比于单独使用Genistin或AG1024处理组,联合使用组在第12天时肿瘤体积减小差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步通过检测各小组小鼠的体重变化,未发现明显差异。结论:1、Genistein与AG1024单独或联合使用可以使前列腺癌细胞放疗后增殖能力降低、凋亡增加及细胞周期停滞,且二者联合使用效果更明显。2、Genistein与AG1024单独或联合使用可以增加前列腺癌细胞放疗后DNA双链损伤。3、Genistein与AG1024可以抑制放疗后前列腺癌细胞DNA的修复,且二者联合使用可起到协同增敏效果4、Genistein与AG1024联合使用可以成为临床放疗增敏的新选择。