玉米(Zea mays L.)作为种植最广泛的粮食作物,具有重要的经济价值,然而玉米受到胁迫后引起的产量和品质下降给农业生产带来巨大损失。当受到病原菌侵害后,玉米会产生植保素来抵御胁迫。萜类植保素是植保素的一种,是萜烯被细胞色素P450氧化酶氧化形成的衍生物。水稻植保素生物合成途径中的P450已被深入研究,参与玉米萜类植保素生物合成的P450还未见报道。因此,鉴定玉米萜类植保素生物合成中的P450基因及其功能,是解析植保素生物合成途径的重要步骤,进而为其代谢调控研究及抗性育种提供基础。本研究通过挖掘前人报道的禾谷镰刀菌侵染玉米后的转录组数据,结合水稻同源基因系统进化分析,筛选玉米萜类植保素生物合成途径中相关的P450基因CYP71Z18。克隆该基因并用大肠杆菌代谢工程手段进行重组表达,通过GC-MS和NMR分析鉴定催化产物的结构,结果表明CYP71Z18具有催化合成倍半萜植保素zealexin A1的功能。通过分析CYP71Z18及上游基因的表达模式,阐明了其参与玉米萜类植保素zealexinA1生物合成的功能。该P450具有广泛的底物适应性,能够与二萜ent-(iso)kaurene反应生成可能的玉米二萜植保素kauralexinA1和B1,同时还与多个水稻二萜反应,并与水稻P450 CYP99A3共同作用催化syn-pimaradiene形成一个新化合物,基于这些结果,将其在水稻中过表达,以利用其广泛的多种催化功能改造水稻二萜植保素代谢途径。本研究得到的主要结果如下:1.通过分析禾谷镰刀菌侵染玉米后的转录组数据,发现CYP71Z18被禾谷镰刀菌高度诱导。将CYP71Z18氨基酸序列与玉米和水稻的CYP71家族基因进行系统进化分析,得出CYP71Z18与水稻二萜植保素合成相关的CYP71Z6和CYP71Z7亲缘关系较近,推测CYP71Z18参与玉米萜类植保素的生物合成。2.在大肠杆菌代谢工程体系内,CYP71Z18连续催化玉米倍半萜(S)-β-macrocarpene形成玉米倍半萜植保素zealexin A1。通过GC-MS检测并对比前人报道的zealexin A1的质谱图,结合NMR结构鉴定结果,确认CYP71Z18连续催化β-macrocarpene,产生β-macrocarpen-15-ol、β-macrocarpen-15-al 和 zealexin A1,其中 zealexin A1 为主产物。3.CY71Z18具有诱导表达的基因表达模式。CY71Z18在整株幼苗各组织部位均有表达,在禾谷镰刀菌孢子接种的玉米叶片中,CY71Z18在48 h内逐渐被诱导。产生β-macrocarpene的ZmTPS6/11在早期也表现出被病原菌强烈诱导的情况。推测这种早期的诱导表达提供了底物合酶,为随后被诱导表达的CYP71Z18提供了底物,这些基因共同参与zealexin A1的生物合成。4.CYP71Z18催化多种参与水稻二萜类植保素合成的二萜形成新化合物。其中,CYP71Z18催化syn-pimaradiene生成推测为C15和C16被氧化的新化合物,且推测该化合物进一步被水稻P450 CYP99A3在C19位点进行羟基化。CYP71Z18分别催化syn-stemarene、syn-labdatriene、syn-stemodene、ent-cassadiene 和 ent-sandaracopimaradiene形成推测为羟基化或羧基化的产物。5.构建了 TO代CYP71Z18过表达水稻株系,有待进一步构建稳定遗传株系,为改造水稻二萜植保素生物合成途径提供研究基础。结论:本研究鉴定出玉米倍半萜植保素zealexin A1生物合成途径中的首个P450即CYP71Z18。CYP71Z18 连续氧化倍半萜 β-macrocarpene 相继形成 β-macrocarpen-15-ol、β-macrocarpen-15-al 和 zealexin A1,其中 zealexin A1 为主产物。同时,CYP71Z18 具有诱导表达的基因表达模式,在整株幼苗各组织部位均有表达,并且能够在禾谷镰刀菌侵染后48 h内逐渐被诱导,其表达模式与zealexin A1积累模式相一致。这表明,CYP71Z18即为参与玉米倍半萜植保素zealexin A1合成的P450。鉴于CYP71Z18还具有氧化多种水稻二萜的功能,本研究试图利用其多样的催化功能来改造水稻二萜植保素的生物合成途径,因此构建了过表达水稻株系,为进一步研究利用该基因的功能提高作物抗性提供基础。