第一部分RKIP通过microRNA-224调控抑制胃癌细胞增殖迁移,促进凋亡背景：胃癌的发病率居恶性肿瘤的第四位,死亡率居第二位,是最常见的恶性肿瘤之一。而胃癌患者的5年生存率并不高,要改变目前的状态,阐明其发病机制显得尤为重要。胃癌的发生与肠上皮化生、慢性萎缩性胃炎、不典型增生等癌前病变密切相关,涉及多种基因的异常。而miRNA在其过程中起重要作用,miRNA能在转录后水平调控各种关键基因。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族成员之一。RKIP能阻断MAPK信号传导通路的活性,抑制Raf-1介导的MEK的活化,进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移,已成为肿瘤领域的一个新的热点。本研究检测RKIP在人胃癌细胞中的表达情况,和对胃癌细胞SGC-7901生物学特性的影响,并观察microRNA-224(miR-224)对靶基因RKIP表达调控作用,为胃癌治疗提供新的治疗方法和策略。方法：定量实时PCR检测RKIP在胃癌细胞系(SGC-7901、MGC80-3、MKN45)中的表达情况。构建RKIP真核表达载体pcDNA3.1-RKIP,并在SGC-7901细胞中转染pcDNA3.1-RKIP48h后,用Western blot检测SGC-7901细胞中RKIP蛋白表达变化;MTT检测RKIP过表达对SGC-7901细胞活力的影响。流式细胞仪分析RKIP过表达对SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响。采用transwell侵袭小室实验方法检测RKIP过表达对SGC-7901细胞迁移的影响。利用荧光报告酶系统检验RKIP是miR-224调控靶基因,并采用Western blot方法检测miR-224对细胞中RKIP蛋白表达的影响。利用MTT,流式细胞仪和transwell侵袭小室检测miR-224对RKIP生物学特性的调控作用。结果：定量实时PCR显示：RKIP在胃癌细胞系较正常胃粘膜上皮细胞系中的表达呈下降趋势(p<0.01).在SGC-7901中转染pcDNA3.1-RKIP 48h后,细胞中RKIP的表达与对照组相比显著上升(p<0.01)。MTT,流式细胞仪和transwell侵袭小室检测结果显示：在SGC-7901细胞中过表达RKIP后,细胞凋亡数增加(p<0.01),细胞活力和S期细胞比例下降(p<0.05),穿过transwell小室的细胞数降低(p<0.05)。荧光素酶报告基因系统的检测结果：与对照组相比,经转染miR-224 mimic组的荧光素酶活力显著降低(p<0.05)。用Western blot检测的结果显示：与非转染组相比,SGC-7901转染miR-224 mimic48h后,细胞中RKIP蛋白的表达量显著下降(p<0.05)。MTT,流式细胞仪和transwell侵袭小室检测结果显示：在SGC-7901中转染miR-224 mimic后,可抑制因过表达RKIP后导致的细胞生物学特性的改变。结论：RKIP在人胃癌细胞系表达下调,miR-224可负调节RKIP蛋白的表达,进而促进肿瘤的活性,RKIP可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。增强RKIP表达的治疗策略有望使胃癌患者受益。第二部分RKIP通过NF-KB/Snail信号通路促进顺铂诱导的胃癌细胞的死亡背景：胃癌化疗的有效率因化疗耐药而明显受限,多数研究者认为肿瘤细胞的凋亡程度是化疗疗效判定的重要指标,肿瘤细胞的凋亡与化疗药物的疗效呈时间、剂量的依赖关系。2013年Martinho O等研究报道了RKIP与子宫颈癌的顺铂化疗敏感性相关。顺铂是目前胃癌术后辅助化疗及术前新辅助化疗中最常用的药物之一,也是目前利用体外培养胃癌组织进行药敏实验的常用药物。研究表明顺铂可以通过结合DNA形成交联进而抑制DNA合成,抑制细胞分裂,最终诱导细胞凋亡,但肿瘤细胞耐药性的存在,极大地降低了顺铂的疗效。本研究通过检测RKIP在人胃癌细胞系SGC-7901中以及顺铂耐药的细胞株SGC-7901/DDP中表达的情况,探讨RKIP在胃癌细胞中对顺铂化疗敏感性的关系以及其作用的信号通路,为胃癌的治疗提供新的方法和策略。方法：分别体外培养人胃癌细胞系SGC-7901及顺铂的耐药细胞株SGC-7901/DDP,用Western blot检测RKIP蛋白在两种细胞中表达的情况。用转染RKIP siRNA的胃癌细胞SGC-7901,经培养48h后,Western blot检测转染后细胞中RKIP蛋白表达量的变化,用MTT检测经转染RKIP siRNA的胃癌细胞细胞活力的变化,以及用MTT和流式细胞仪检测RKIP的异位表达对顺铂诱导的耐药胃癌细胞活力和对细胞凋亡的影响。采用Western blot方法检测RKIP异位表达对顺铂诱导的胃癌细胞中NF-κB和Snail表达的影响。结果：Western blot检测结果表明：RKIP在顺铂耐药细胞株SGC-7901/DDP中的表达量较胃癌细胞SGC-7901明显下降(p0.05)。与对照组相比,在SGC-7901细胞中转染RKIP siRNA48h后,细胞中RKIP的表达显著下降(p<0.01). MTT检测结果显示：在SGC-7901细胞中转染RKIP siRNA后,细胞活力明显上升(p<0.05),在SGC-7901/DDP细胞中转染RKIP重组表达质粒后,细胞的活力明显下降(p<0.05)。流式细胞仪和MTT的结果显示：胃癌细胞SGC-7901抑制RKIP表达后,即使在顺铂作用下,肿瘤细胞凋亡的数量明显减少(p<0.05),细胞的活力也明显上升(p<0.05);顺铂的耐药细胞株SGC-7901/DDP细胞过表达RKIP后,即使在顺铂作用下,细胞的凋亡也显著增加(p<0.05),细胞的活力下降(p<0.05)。Western blot检测结果显示：在SGC-7901细胞中,抑制RKIP的表达,可明显促进NF-κB表达的升高(p<0.05)；而在SGC-7901/DDP细胞中,促进RKIP的表达,可明显抑制Snail的表达(p<0.05)。结论：RKIP蛋白在SGC-7901/DDP细胞株中表达下调,过表达RKIP可使胃癌细胞对顺铂的敏感性增强,其作用机制可能是通过NF-κB/Snail信号通路。第三部分RKIP通过调控1HMGA2和OPN的表达来抑制胃癌细胞的存活和迁移背景：高迁移率族蛋白A2(HMGA2),在多种恶性肿瘤中发挥重要作用。Sugiko等发现,在人类胰腺癌中,HMGA2是MEK的间接靶基因,可以与Snaill基因启动子区域结合,抑制E-cadherin的转录,从而促进了胰腺癌细胞上皮间质转化。我们前期的研究结果显示了,RKIP在人胃癌细胞系的表达下调,并可抑制胃癌细胞增殖和侵袭。关于RKIP抑制胃癌细胞增殖、侵袭和促进凋亡的机制,已有的研究显示,HMGA2是MEK的间接靶基因,由此推断,RKIP可能通过抑制MEK的活化来抑制HMGA2的生物学作用,从而发挥其抑制胃癌细胞增殖、侵袭和促进凋亡的生物学作用。本研究探讨RKIP抑制胃癌细胞存活,侵袭和促进凋亡的机制,为RKIP应用于胃癌治疗提供理论依据。方法：构建RKIP和HMGA2重组表达质粒pcDNA3.1-RKIP和pcDNA3.1-HMGA2,利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-RKIP或RKIP-shRNA转染进胃癌细胞系SGC-7901细胞中,实时定量PCR或Western blot检测RKIP在SGC-7901细胞中异位表达后,细胞中RKIP、HMGA2和OPN mRNA和蛋白表达变化。将重组质粒pcDNA3.1-HMGA2或HMGA2-shRNA转染进胃癌细胞系SGC-7901细胞后,Western blot检测HMGA2在SGC-7901细胞中表达变化。并利用流式细胞仪和transwell分析法检测,在胃癌细胞SGC-7901中异位表达HMGA2后,HMGA2对SGC-7901细胞的增殖、凋亡和侵袭的影响。为了进一步探讨RKIP对HMGA2生物活性的调控作用,在SGC-7901细胞中同时过表达RKIP和HMGA2,或同时干扰RKIP和HMGA2,并利用流式细胞仪和transwell分析法检测其对SGC-7901细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。结果：实时定量PCR和Western blot检测结果显示：在SGC-7901细胞中转染pcDNA3.1-RKIP后,RKIP mRNA和蛋白表达显著增高(p<0.01),而HMGA2和OPN mRNA和蛋白表达则显著降低p<0.01)；而在SGC-7901细胞中转染RKIP-shRNA后,结果则相反。在SGC-7901细胞中转染pcDNA3.1-HMGA2后,细胞中HMGA2蛋白表达显著增高(p<0.01),而细胞中转染HMGA2-shRNA后,HMGA2蛋白表达显著降低(p<0.01)。流式细胞仪和transwell分析结果显示：在SGC-7901细胞中,过表达HMGA2后,细胞(G2+S)比例[(G2+S) phase fraction]显著升高(p<0.01),凋亡细胞比例明显降低(p<0.05),侵袭细胞数明显增多(p<0.05)；而干扰HMGA2表达后,以上结果则相反。在SGC-7901细胞中同时过表达RKIP和HMGA2,或同时干扰RKIP和HMGA2,同时过表达或同时干扰组的细胞(G2+S)比例、凋亡细胞比例和侵袭细胞数,与对照组相比,差异不显著(p>0.05)。结论：RKIP可能通过其调节HMGA2或OPN的表达抑制胃癌细胞的生物学活性。