抑癌基因p14ARF启动子异常甲基化对肺癌生物学功能影响

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目的:肺癌是目前最常见的呼吸系统恶性肿瘤,研究中发现肺癌拥有所有癌症中最高的死亡率,其死亡人数约占所有癌症的26%。肺癌根据其病理类型可以分为小细胞肺癌(Small cell lung carcinoma,SCLC)与非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC),其中非小细胞肺癌的发病率较小细胞肺癌高。p14ARF是位于人类9号染色体短臂2区1带(9p21)基因位点上的抑癌基因,而p14ARF基因启动子区域异常甲基化在肺癌与癌旁组织存在明显差异,提示p14ARF基因启动子区域异常甲基化与肺癌的发生发展有着密切的关系。我们的目的是研究抑癌基因p14ARF启动子区域异常甲基化对肺癌生物学功能的影响。方法:首先利用巢式甲基化特异性PCR(Nest methylation-Specific PCR,NMSP)检测人肺癌细胞系SPCA1及人正常支气管上皮细胞系BEAS2B中p14ARF启动子区域甲基化情况,然后根据细胞类型及是否进行5-氮杂-2脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza)处理将细胞分为4组:SPCA1 5-Aza处理组、SPCA1对照组、BEAS2B 5-Aza处理组、BEAS2B对照组,每组设置3个复孔。后进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测p14基因mRNA表达情况,蛋白印迹法(Western blot)检测各组细胞中p14基因的蛋白表达情况,确定启动子区域甲基化对于肺癌细胞系SPCA1基因表达的影响及5-Aza是否对正常细胞系BEAS2B产生影响。最后通过流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)进行细胞凋亡检测,确定去除甲基化后是否促进癌细胞凋亡,再进行细胞增殖检测(Cell Counting Kit-8,CCK8)检测其对细胞活性的影响。结果:NMSP检测到SPCA1细胞p14启动子区域存在异常的甲基化状态而在BEAS2B细胞中则不存在这种甲基化,经过qRT-PCR和Western blot检测发现SPCA1细胞系中无p14mRNA和ARF蛋白的表达,而在BEAS2B中该mRNA与蛋白质则正常表达。之后,我们比较了SPCA1细胞系5-Aza处理组与其对照组及BEAS2B细胞系5-Aza处理组与其对照组,经过5-Aza去除p14基因启动子区异常甲基化后,检测到SPCA1细胞中p14基因mRNA的表达明显增加,比正常组多0.63倍(p<0.05),Western blot检测发现其ARF蛋白恢复表达,并且经过去除p14基因异常甲基化后,SPCA1细胞凋亡率明显增加(实验组凋亡率为22.36±2.04%,对照组细胞凋亡率为10.96±0.63%,P<0.05),细胞增殖抑制率也明显增加(细胞处理24h,48h,72h,96h后凋亡率分别为39%,40%,42%和52%);而在BEAS2B细胞系中ARF蛋白表达、p14mRNA表达、细胞凋亡率、细胞增殖抑制率都无明显差异(p>0.05)。结论:我们的研究表明肺癌细胞系SPCA1中p14ARF基因启动子区域存在异常甲基化,可以影响其表达从而导致p14mRNA、ARF蛋白的无法合成,因此抑制细胞凋亡,从而加快肺癌细胞增殖,对肺癌的发生起到促进作用。它可以作为肺癌诊断治疗的研究靶点,为后续研究提供一个方向,使癌症治疗多了一个途径,去甲基化剂也为研究肺癌联合用药治疗提供了可能的方案。
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