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热应激（HS）是炎热季节和地区危害人畜健康最严重的应激源之一。肝损伤是HS病例中最常见且致命的并发症,其机制涉及氧化应激和炎症反应。开发安全、有效和廉价的预防HS的营养添加剂已成为当前研究热点。少数研究注意到骆驼乳清蛋白（CWP）具有比其他动物乳清蛋白更强的抗氧化和抗炎活性,并因此具有抗HS所致肝损伤的潜在医用价值。但关于CWP能否及以何种方式缓解HS诱导的肝损伤及功能障碍的研究尚未见报道。因此,本研究评估了CWP的大鼠抵抗HS所致肝损伤的能力,并进一步探讨了其作用机制。研究内容如下:1.HS致Sprague-Dawley（SD）大鼠肝损伤模型的建立。以大鼠尾动脉收缩压（SBP）和体核温度（Tc）为指标评价了大鼠的HS状态,并以肝脏病理组织学变化及血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性作为参考指标评价了肝损伤程度。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清和肝脏白细胞介素1β（IL-1β）水平。结果显示,大鼠SBP在第7 d HS后达到峰值128.37±2.04 mm Hg,第8 d后下降,同时Tc升高至43℃。在此HS处理下,肝组织切片经苏木素伊红（HE）染色后可见大量肝细胞水肿坏死,并伴随着血清ALT、AST活性和血清、肝脏IL-1β水平的升高,表明大鼠肝脏发生炎症反应和损伤。据此,本研究所确立的HS程序为:每天将大鼠置于温度为40±0.2℃,相对湿度为60-65%的人工气候箱内HS处理2 h,连续处理8 d。2.评估CWP对HS所致肝损伤的预防作用。给6周龄SD大鼠每天灌服100、200和400 mg/kg的CWP,2周后开始于每次灌服CWP后1 h按上述程序进行HS处理。最后一次HS处理结束并于标准环境恢复24 h后,采集血液和肝脏样品。应用HE染色评价CWP对HS大鼠肝脏病理组织学改变的影响。用试剂盒检测大鼠血清ALT活性。ELISA方法检测大鼠血清和肝脏IL-1β水平。用TUNEL染色试剂盒检测肝细胞凋亡。大鼠在经历整个HS程序后,每隔3 h用体温测量仪记录一次Tc。结果显示,CWP以剂量依赖方式缓解了HS诱导的大鼠病理组织学改变和细胞凋亡,抑制了血清ALT活性及IL-1β水平的升高,并促进了HS后Tc的恢复。由此表明,CWP对HS诱导的大鼠肝损伤具有预防作用。3.CWP对HS致大鼠肝脏炎性损伤的预防机制研究。含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）炎性小体是一种关键的炎症信号因子,其在介导HS所致肝损伤中发挥着重要作用。鉴于此,本研究评估了CWP对HS大鼠模型中肝细胞NLRP3炎性小体活性的抑制能力。在对大鼠进行HS处理前,通过腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂（CY-09）或高迁移率族蛋白1（HMGB1）拮抗剂（甘草酸）探究了CWP的抗炎机制。HE染色观察大鼠肝脏病理组织学变化。用试剂盒测定IL-1β含量和半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、ALT活性。采用免疫组化染色或Western blotting方法检测HMGB1、晚期糖基化终产物受体（RAGE）、NLRP3炎性小体、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白的表达量。结果表明,HS激活了大鼠肝脏中的NLRP3炎性小体,表现为Caspase-1活性增强和IL-1β含量增加。CY-09抑制NLRP3炎性小体的活化可逆转Caspase-3和Bcl-2在大鼠肝细胞中的异常表达和核转位,减轻肝细胞凋亡、坏死和随后的肝损伤。此外,甘草酸可抑制HS对NLRP3炎性小体的激活,表明NLRP3炎性小体的活化依赖于HMGB1的释放。值得注意的是,CWP亦可逆转HS导致的大鼠肝脏中HMGB1、RAGE、NLRP3、IL-1β、ALT、Bcl-2和Caspase-3的异常表达,抑制Caspase-1的活性,减轻肝细胞凋亡和肝脏病理学改变,而CWP联合甘草酸则可完全阻止HS诱导的肝细胞凋亡和损伤。上述结果表明,CWP可通过抑制HMGB1/RAGE/NLRP3信号通路预防HS所致的大鼠肝损伤。4.CWP抑制HMGB1释放的机制研究。首先,使用活性氧（ROS）抑制剂—N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）证实了氧化应激是诱导HMGB1释放的关键。其次,评估了CWP增强肝脏抗氧化活性的能力。结果显示,CWP通过降低ROS、丙二醛（MDA）水平和NADPH氧化酶（NOX）活性,增加还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）/氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）的比值,同时通过上调超氧化物歧化酶（SOD:Cu Zn SOD和Mn SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GSH-Px1）、过氧化氢酶（CAT）、血红素加氧酶（HO-1）、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）和谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）的表达量,抑制了HS所致大鼠肝脏的氧化应激。值得注意的是,CWP可通过激活核因子红血球2-相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路降低肝细胞中HMGB1的细胞质移位,从而预防肝损伤,因为Nrf2抑制剂（ML385）或HO-1抑制剂（Zn PP）均可抑制CWP对该通路的激活作用。同时,CWP亦可增强丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）的磷酸化水平,而磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂（LY294002）则阻断了Nrf2通路的激活。由此表明,CWP可通过激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路发挥对HS致肝损伤的预防作用。CWP联合NAC则更好的消除了HS对肝脏的不良影响。综上可知,CWP对HS致大鼠肝损伤具有良好的预防作用,其可能机制与激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路增强肝脏的抗氧化能力,以及抑制HMGB1/RAGE轴所介导的NLRP3炎性小体的激活有关。