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半纤维素是木质纤维素生物质的主要成分之一,将其酶解并转化为可发酵单糖(木糖和阿拉伯糖)或者高附加值产品(低聚木糖和阿魏酸)对于木质纤维素的高效利用具有重要意义。由于半纤维素复杂的化学结构,其降解需要多种主链水解酶(木聚糖酶和木糖苷酶)和侧链水解酶(阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶)的协同作用。目前,半纤维素酶生产成本较高而且其协同作用机理尚未完全阐明,从而限制了半纤维素的高效利用。本论文从黑曲霉中克隆了 GH11家族内切β-1,4-木聚糖酶,CE1家族乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶A等基因并在毕赤酵母中高效表达以构建完整的半纤维素水解酶体系。利用重组半纤维酶对竹材加工剩余物和小麦麸皮进行协同酶解,研究半纤维素酶协同作用机理,实现半纤维素的高效酶水解转化为高附加值产品。本研究的主要结果如下:(1)乙酰木聚糖酯酶基因的克隆与表达。利用PCR技术,从黑曲霉(Aspergillus niger)BE-2中克隆得到了编码乙酰木聚糖酯酶(AnAxe)的cDNA基因片段,该片段长912 bp,编码304个氨基酸。构建了重组表达载体(pPIC9K-4AnAxe)并转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115基因组中。重组酶AnAxe在诱导表达7 d后,酶活达87IU/mL。对重组乙酰木聚糖酯酶的酶学特性以及和其它半纤维素酶协同酶解竹生物质进行研究。酶学特性分析结果表明:AnAxe最适反应温度为40℃,最佳pH为7.0,热稳定性较好,在50℃以下能够保持较高的酶活。(2)乙酰木聚糖酯酶协同降解木聚糖。以球磨后的竹屑为底物,当300 IU GH10家族木聚糖酶(AnXyn1OC)单独作用于球磨后的竹屑时,还原糖的释放率为11.2%,而当在反应体系中添加5IU的AnAxe时,还原糖得率提高至19.6%,说明侧链基团的脱除促进了木聚糖酶对木聚糖的水解。同时在添加AnAxe和AnXyn1OC的基础上添加其它半纤维素酶:AnXln3D、AnAxh62A、AnGus67,研究其协同程度,结果显示添加三种半纤维素酶后,还原糖的得率进一步提高,其协同程度分别为1.30、1.18、1.15。(3)阿魏酸酯酶A基因的克隆与表达。从黑曲霉BE-2中克隆得到了编码阿魏酸酯酶A的cDNA基因序列,该序列全长为903 bp,编码301个氨基酸序列。通过Swiss-Model对AnFaeA蛋白结构进行预测,发现其为典型的α/β折叠水解酶结构,且经比对分析发现其具有Ser154-Asp215-His268活性位点催化三联体结构。构建了重组表达载体(pPIC9K-AnFaeA)并通过电转化方式导入毕赤酵母GS115基因组中。重组阿魏酸酯酶经1%甲醇诱导培养7d后,以阿魏酸甲酯为底物测得重组酶酶活为21 IU/mL。酶学性质研究结果表明:AnFaeA的最适反应温度和pH分别为45℃和5.0,在50℃具有较好的热稳定性。(4)GH11家族木聚糖酶基因的克隆与表达。从黑曲霉BE-2中克隆得到了GHI1家族木聚糖酶基因AnXyn11A,该基因全长696 bp,编码232个氨基酸。3-D结构预测表明AnXyn11A与大多数GH11家族的木聚糖酶结构类似,呈现右手半握拳状,由2个β折叠片和1个α折叠构成。以质粒pPIC9为载体,构建目的基因表达载体pPIC9-AnXyn11A,转化毕赤酵母GS115,筛选阳性转化子。重组AnXyn11A诱导表达7 d后,AnXyn11A的酶活力可达到240 IU/mL。对重组酶酶学性质进行研究,结果发现:AnXyn11A在pH 5.0和60℃的反应条件下表现出最佳酶活,在50℃以下保持稳定。(5)半纤维素酶协同酶解麦麸。研究了 AnFaeA和AnXyn11A协同降解小麦麸皮获得高附加值产品。当单独添加AnFaeA时,小麦麸皮中阿魏酸的最大释放率仅为16.8%,当添加了 AnXyn11A时,阿魏酸的释放率最大达到70%。结果表明,木聚糖酶和阿魏酸酯酶在释放阿魏酸中存在着明显的协同作用。同时添加AnFaeA(100 IU)和AnXyn11A(300 IU)时的低聚木糖释放量是单独添加AnXyn11A(300IU)的两倍,表明木聚糖酶和阿魏酸酯酶在生产低聚木糖中存在明显的协同作用。本论文实现了 CE1家族乙酰木聚糖酯酶、CE1家族阿魏酸酯酶A、GH11家族木聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达;乙酰木聚糖酯酶和其它半纤维素酶在水解竹屑表现出显著的协同效应;利用木聚糖酶和阿魏酸酯酶A协同水解麦麸,大幅提高了高附加值产品—阿魏酸和低聚木糖的得率。