【摘 要】
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海豚链球菌（Streptococcus iniae）感染会引起鱼类疾病爆发,已有报道指出该菌会使卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）、尼罗罗非鱼（Oreochromis nilotica）和石斑鱼（E pinephelus spp.）等发生脑膜炎和败血症,临床症状表现为体表发黑,嗜睡、游动缓慢、眼球突出、充血、浑浊,肝脾脏肿大和出血,死亡率高达50%。中国、美国和澳大利亚等多个国家报道
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海豚链球菌（Streptococcus iniae）感染会引起鱼类疾病爆发,已有报道指出该菌会使卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）、尼罗罗非鱼（Oreochromis nilotica）和石斑鱼（E pinephelus spp.）等发生脑膜炎和败血症,临床症状表现为体表发黑,嗜睡、游动缓慢、眼球突出、充血、浑浊,肝脾脏肿大和出血,死亡率高达50%。中国、美国和澳大利亚等多个国家报道了鱼类链球菌的暴发,已造成巨大经济损失。此外该菌也是一种人鱼共患菌,患者主要症状表现为手的蜂窝织炎,若患有心脏病、糖尿病和关节炎等的病人感染链球菌,感染症状更严重。为减少海豚链球菌病大规模传播,本实验建立的针对海豚链球菌Mts R建立的快速准确的检测技术显得尤为重要。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）利用Primer Explorer 5设计的特异引物和Bst DNA聚合酶在恒温（60~65℃）下扩增,相比于传统检测方法该法操作简单、快速高效,已在人类疾病检测和诊断领域中应用。本研究通过筛选海豚链球菌特异性序列,建立LAMP检测方法,对海水养殖业的健康发展具有重要意义,也为海豚链球菌的科学防控提供一种有效检测技术。研究结果如下:（1）LAMP检测方法的建立:本研究以海豚链球菌特异序列Mts R基因为靶标设计引物,分别对反应条件中的温度、时间、反应过程以及反应体系中的d NTPs、Mg2+、甜菜碱和内外引物比例进行优化,最终确定最佳反应体系为:61℃反应50 min,镁离子浓度为1.2 mmol/L、d NTPs浓度为0.64 mmol/L、内外引物比例为16:1,最后用DEPC处理水补足体系。扩增产物使用限制酶Alu I进行酶切验证,不能被Bam H I消化,且产物大小符合预期,表明本实验成功建立了海豚链球菌LAMP检测方法。本研究使用d UTP-UDG系统建立了防污染LAMP体系,并用不开盖检测的钙黄绿素-锰离子法、羟基萘酚蓝法作对照,结果一致证明d UTP-UDG防污染体系可有效避免气溶胶污染。（2）LAMP特异性和灵敏度鉴定:对包括海豚链球菌在内的33种参考菌株进行特异性验证。结果显示,仅对海豚链球菌检测结果为阳性,表明该方法特异性良好。灵敏度检测结果表明,LAMP检测灵敏度为18.8×10-6 ng/μL,时PCR检测灵敏度的100倍。（3）LAMP可视化检测与临床分析:用SYBR Green I、钙黄绿素-锰离子、羟基萘酚蓝、孔雀石绿、横向流动试纸条方法对LAMP体系扩增结果进行判读,实现了检测结果的可视化。将本研究建立的LAMP方法应用于临床中,对海豚链球菌、无乳链球菌和哈维氏弧菌感染的罗非鱼病样进行检测,结果表明该LAMP方法在模板中存在鱼类基因组干扰下也能正确完成检测。综上所述,本研究中建立的LAMP检测方法为海豚链球菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。
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