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研究背景:胰腺癌作为恶性程度最高、预后最差的几种癌症之一,也是常见的癌症相关死亡的主要原因之一。从胰腺癌的病理分型来看,胰腺导管腺癌（PDAC）占全部类型的90%。而KRASmutant基因突变是PDAC发生的过程中最为常见的突变,KRAS突变后持续地激活了下游的信号通路,主导着PDAC的恶性行为。由于KRAS蛋白的分子结构除了 GTP结合位点外,无其余有用的口袋,直接作用于KRAS的小分子抑制剂迟迟无法应用,KRAS也一直被称为“不可成药”的靶点。近来,针对KRASG12C位点突变的新型小分子抑制剂AMG510在非小细胞肺癌患者中初见成效,但AMG510仅针对KRASG12C位点,而对于在胰腺癌患者中更为常见的KRASG12D位点没有作用;因此,明确KRASG12D在PDAC中的作用机制同时对其进行调控对于PDAC的治疗具有极为重要的意义。碳水化物是PDAC的主要供能物质,不同于正常组织,PDAC选择了更高比例的糖酵解作为其主要供能方式,糖酵解的中间产物及快速的能量产生提供了 PDAC生长、增殖、迁移和侵袭过程所需要的原料和底物,因此我们认为高度糖酵解的特性至少可以提示PDAC的恶性程度。成纤维生长因子（FGF）家族被发现可以诱导有丝分裂的发生,延长细胞的生存时长,同时也参与多种生物过程。其中,FGF21被发现在脂肪细胞中可促进GLUT-1对细胞外葡萄糖的吸收,相对地促进糖酵解的进程;胰腺来源的FGF21还可以维持肥胖小鼠的能量和代谢稳态。在肿瘤形成的早期,KRASG12D的突变下调了胰腺来源的FGF21的表达,同时外源性的FGF21可以逆转高脂饮食诱发KRASG12D突变小鼠胰腺癌的发生。但是在胰腺癌的发展阶段,KRASG12D对于FGF21的调控作用以及其下游对PDAC恶性表型的作用及其机制尚未可知。目的:本研究使用了两株具有KRASG12D突变的PDAC细胞系,PANC-1以及AsPC-1,基于siKRAS的转染技术瞬时沉默两株细胞系中的KRASG12D表达,进而对其糖酵解水平、增殖、迁移和侵袭能力等恶性表型进行评估;接着利用siFGF21转染及FGF21慢病毒转导两组细胞系,评估FGF21对于KRASG12D细胞系恶性表型的影响,进一步探讨在胰腺癌细胞系中KRASG12D与FGF21之间的调控关系;随后,我们通过共转染siKRAS和siFGF21的手段试图靶向基因调控,对PDAC进行基因治疗。方法:首先利用TCGA数据库,对胰腺癌相关数据进行挖掘,利用Spearman相关性分析探究KRAS、FGF21和KLB之间的相关性;接着利用Western Blot和PCR技术检测胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮中蛋白表达变化;通过RNAi转染技术检测胰腺癌细胞系中关键分子的表达;构建皮下裸鼠移植瘤模型,给予纳米核酸治疗。结果:（1）依据肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库对KRAS,FGF21,KLB,FGFR的PDAC患者进行生存分析发现,高表达KRAS的PDAC患者具有更短的生存期,而FGF21和KLB仅在早期PDAC患者中表达,FGFR的表达不会影响PDAC患者生存状况。利用Spearman相关性分析发现KRAS和FGF21、KLB成负相关,KRAS和FGFR成正相关。（2）检测两株KRASG12D突变的PDAC细胞系（PANC-1和AsPC-1）和人的胰腺导管上皮（HPDE6-C7）细胞系的蛋白和mRNA表达情况,相较于HPDE6-C7,AsPC-1和PANC-1细胞具有明确的KRASG12D位点突变以及更高表达的KRAS和糖酵解相关分子以及更低的FGF21及其共受体KLB表达。经过不同的处理方式（糖酵解抑制或无糖培养）处理各组细胞后,检测其增殖能力,CCK-8结果示相比于HPDE6-C7,AsPC-1和PANC-1组对于葡萄糖的缺乏和糖酵解的抑制更为敏感。（3）利用RNAi技术,对KRASG12D的表达进行调控。通过凝胶阻滞实验验证脂质体对siKRAS的装载效果,通过TEM透射电镜验证组装后复合物形貌和粒径大小,结果显示当脂质体和siKRAS质量比为2:1时,脂质体和siKRAS完全组装,粒径约为200 nm。接着利用倒置荧光显微镜和流式细胞术等手段分析复合物的入胞效率,发现入胞效率接近100%。RT-qPCR结果显示siKRAS纳米复合体特异地诱导了 mRNA的沉默。（4）检测培养液中的葡萄糖和乳酸含量,发现转染siKRAS引起了葡萄糖消耗和乳酸产生的减少;同时,经过CCK-8等实验发现转染了 siKRAS后引起PDAC细胞生长和增殖能力减弱;划痕和Transwell侵袭的结果展示siKRAS损害其迁移和侵袭能力。Western Blot等方法证明了 KRAS通过激活Raf/Erk/HIF-1α调控糖酵解过程,同时表明下调KRASG12D伴随着FGF21的表达增高。（5）构建稳定过表达FGF21的AsPC-1细胞株,发现该细胞株展现出更强的增殖、迁移和侵袭能力。分析其蛋白表达变化还发现该细胞KRASG12D的高表达以及下游Raf/Erk/HIF-1 α通路的激活;以及KRASG12D的直接调控因子SOS-1和KLB的高表达。接着,敲减FGF21后发现,siFGF21的转染对AsPC-1的恶性表型无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示FGF21的敲减不影响KRASG12D的表达和激活,同样也不影响SOS-1的表达含量。（6）在AsPC-1中共转染siKRAS-siFGF21并评价其恶性表型的变化,发现共转染siKRAS和siFGF21组有更低的增殖、迁移和侵袭能力和糖酵解过程。构建体内裸鼠胰腺癌移植瘤模型,每三日给予核酸纳米复合物进行基因治疗,结果显示共转染组肿瘤体积最小,生长速度最慢。提示了共转染siKRAS-siFGF21在动物水平对PDAC的治疗效果结论:综上,本论文针对最为常见的突变类型,KRASG12D突变的胰腺癌细胞系,利用寡核酸siKRAS为工具,调控KRASG12D的表达从而评估KRASG12D对于AsPC-1、PANC-1恶性表型的影响;同时利用siFGF21和FGF21过表达病毒为工具,探索FGF21对PDAC细胞恶性表型的影响以及FGF21和KRASG12D之间的调控关系;最后我们通过共转染siKRAS-siFGF21的手段靶向PDAC的基因,实现PDAC的基因治疗。