研究背景宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。2015年《中国癌症统计报告》指出,2000年到2011年宫颈癌的发病率和死亡率逐年上升,尤其在34～44岁年龄组中,宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中高居第二位。尽管近年来宫颈癌诊疗技术水平明显提高,但国际癌症研究机构(IRAC)2018年《全球统计报告》显示,2018年全球宫颈癌新发病例为569,847例,死亡人数为311,365人;宫颈癌新发病例比例(13.1%)和死亡比例(6.9%)在女性恶性肿瘤中均高居第四位。因此,宫颈癌在世界范围内仍然严重威胁着女性的健康。宫颈癌通常是由高危人类乳头瘤病毒(HPV)的持续感染引起的细胞异常生长所致。近几十年来,随着癌症筛查的普及和HPV疫苗的引入,大多数国家宫颈癌发病率呈下降趋势。令人遗憾的是,宫颈癌临床治疗策略进展缓慢,手术、化疗和放疗仍然是宫颈癌患者的主要治疗方法。虽然,同步放化疗对于局部进展的宫颈癌可取得一定的临床疗效,但是对于转移、复发的晚期宫颈癌患者的预后改善有限,亟需寻找低毒、有效的治疗方式,分子靶向治疗的发展为其提供了新的方向。但是,目前对宫颈癌有确切疗效的靶向治疗药物效果有限,探索更有效的分子靶点,对宫颈癌早期诊断及生存改善意义重大。脂质通过参与细胞信号、细胞膜、细胞间连接等生物学行为,在细胞存活、增殖和凋亡中发挥着重要作用,与癌症的转化、进展和转移密切相关,这表明生物活性脂质是致癌过程的介质。已有研究报道,低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1B(LRP1B)作为结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、透明细胞肾癌的预后标志物,在肿瘤发生发展中发挥重要作用。低密度脂蛋白受体相关蛋白11(LRP11)是低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)家族的新成员,我们发现LRP11在宫颈高级别鳞状上皮内病变及宫颈癌患者中呈高表达趋势,并且根据生物信息分析学分析发现这种异常高表达可能提示患者预后不良。然而,其机制尚不清楚。本课题中,我们拟检测LRP11在宫颈癌中的表达水平及其生物功能意义,并以P16为共同检测指标,探讨LRP11作为宫颈癌诊治靶点及预后因子的可能性,研究分为以下三个部分:第一部分:LRP11在宫颈癌中的表达和临床预后的相关性研究研究目的:检测宫颈癌患者LRP11的表达水平,探讨LRP11与宫颈癌临床病理特征、生存预后的相关性。研究方法:1.利用生物信息分析学预判LRP11与宫颈癌的相关性:在GEO数据库中,下载LRP11与宫颈癌相关的原始数据,并采用GraphPad软件进行数据分析。然后在Oncomine数据库和GEPIA数据库中输入LRP11进行生存分析相关预判,验证GEO数据库的分析结果。2.采用免疫蛋白印迹(Western blot)方法检测LRP11在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达;免疫组织化学染色(IHC)技术检测LRP11、P16在正常宫颈组织、宫颈高级别鳞状上皮内病变及宫颈癌组织中的表达差异。3.Pearson’sχ~2检验分析LRP11、P16表达水平与宫颈癌患者临床病理特征间的相关性,并采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析LRP11、P16对宫颈癌患者的生存预后价值。研究结果:1.LRP11在宫颈痛中高表达,与P16表达呈正相关:Westen blot结果证实:与正常宫颈组织相比,宫颈癌组织中LRP11/β-actin的相对蛋白含量明显升高(0.74±0.25vs.0.30±0.13,p<0.05)。免疫组化结果显示:相比于正常宫颈组织,宫颈高级别鳞状上皮内病变和宫颈癌组织中LRP11的表达水平明显升高(p<0.0001),且P16的表达水平与病理级别的变化也显著相关(p<0.001)。Pearsonr检验结果提示:LRP11表达与P16表达呈正相关(r=0.5407,p<0.001)。2.LRP11高表达与宫颈癌低分化相关:根据本课题收集的组织样本免疫组化评分的中位值(LRP11=126.02 vs.P16=142.04)将50例宫颈癌组织样本分为LRP11高表达组(28例,56%)、LRP11低表达组(22例,44%)和P16高表达组(34例,68%)、P16低表达组(16例,32%),分析结果显示,LRP11表达与宫颈癌分化程度相关(P=0.0266),但与年龄、组织学、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移或淋巴血管间隙受累无关;P16的表达水平与宫颈癌上述临床病理变量均无明显相关性(p>0.05)。3.LRP11高表达提示临床预后不良:Kaplan-Meier法和log-rank检验生存分析结果显示,与低表达LRP11的宫颈癌患者相比,LRP11高表达的患者总生存时间(Overall survival,OS)明显缩短(log rank p=0.0210);然而,P16的表达与宫颈癌患者的OS之间没有相关性(log rank p=0.7941)。研究结论:1.LRP11在宫颈癌中高表达,与P16表达水平正相关,与肿瘤分化程度显著相关。2.LRP11高表达明显缩短了宫颈癌患者的OS,有望成为宫颈癌患者临床预后有效的预测因子。第二部分:LRP11影响宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭的实验研究研究目的:探索LRP11对宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响,并分析相关分子机制。研究方法:1.构建下调LRP11表达的sh-LRP11质粒,以空载质粒NC组作为对照,通过慢病毒载体转染及嘌呤霉素筛选后,得到稳定下调宫颈癌LRP11表达水平的细胞株。采用Western blot技术对2种宫颈癌细胞系SiHa和CaSki对应的sh-LRP11组、NC组中LRP11蛋白的表达进行检测,确定转染后的宫颈癌细胞中LRP11呈现低表达,同时检测2种宫颈癌细胞系sh-LRP11组、NC组P16的表达情况,分析LRP11对P16表达的影响。2.通过CCK8实验、流式细胞术和Transwell侵袭实验,检测下调LRP11表达后宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的变化,并进一步检测细胞周期调节蛋白(CDK 2/4、cyclin D1/E1)、凋亡相关蛋白(cleaved PARP、BcL-xL,、Bax)和侵袭相关蛋白(MMP-2、MMP-9、VEGF)的表达变化。研究结果:1.转染后宫颈癌细胞中LRP11和P16的表达水平均降低:Western blot结果显示,SiHa细胞和CaSki细胞转染sh-LRP11后,与NC组相比,LRP11与P16蛋白表达均下调。将LRP11、P16分别与β-actin内参蛋白的光密度值进行计算,结果显示,与NC组相比,下调宫颈癌细胞中LRP11表达,导致P16表达下降(p<0.05)。2.下调LRP11表达,可抑制宫颈癌细胞系的增殖活力:CCK8结果显示,SiHa细胞sh-LRP11组细胞增殖活力在12 h和24 h时低于NC组,CaSki细胞sh-LRP11组细胞增殖活力在24h和48 h时低于NC组。SiHa细胞在转染12h时,sh-LRP11组和NC组的细胞增殖活力分别为16.1%和18.3%(p<0.05);转染24h时,两组细胞增殖活力分别为19.8%和21.3%(p<0.01)CaSki细胞转染24h、48h时,sh-LRP11组和NC组细胞增殖活力分别为21.6%vs.22.3%(p<0.05)和39.5%vs.42.3%(p<0.001)。3.下调LRP11表达,可将宫颈癌SiHa和CaSki细胞阻滞在G0/G1期,抑制CDK2/4和cyclinD1/E1的表达:流式细胞周期检测结果显示,与NC组相比,SiHa细胞和CaSki细胞sh-LRP11组在G0/G1期被抑制。SiHa细胞转染sh-LRP11后,与NC组相比,G0/G1期细胞比例分别为59.8%和54.1%;而S+G2/M期细胞比例则分别为40.2%和45.9%(p<0.001)。CaSki细胞转染sh-LRP11后,与NC组相比,G0/G1期细胞比例分别为37.8%和24.6%;而S+G2/M期细胞比例则分别为62.2%和75.4%(p<0.001)。Westtrn blot结果显示,CDK2、CDk4和Cyclin D1、Cyclin E1等细胞周期调控蛋白受LRP11表达的影响;与NC组相比,下调宫颈癌中LRP11可抑制CDK2、CDK4和Cyclin D1、Cyclin E1的表达。4.下调LRP11可诱导SiHa细胞早期凋亡,对CaSki细胞凋亡无影响:流式凋亡检测结果证实,LRP11可诱导SiHa细胞早期凋亡,对CaSki细胞凋亡无影响。下调LRP11后,SiHa细胞sh-LRP11组和NC组早期凋亡率(Pl-/Annexin+)分别为2.33%和1.94%(p<0.05);而两组晚期凋亡率(5.89%和5.40%)之间差异无统计学意义。CaSki细胞sh-LPR11组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为4.08%和1.03%,与NC组(4.12%和0.98%)无明显差异。进一步的Western blot检测结果显示,LRP11下调后,促凋亡蛋白cleaved-PARP和抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达降低,促凋亡蛋白Bax的表达增加,但无统计学差异。5.下调LRP11可显著抑制宫颈癌细胞的侵袭能力,降低MMP-2、MMP-9、VEGF等蛋白的表达:Transwell侵袭实验结果显示,与NC组相比,两种宫颈癌细胞sh-LRP11组细胞迁移和侵袭穿过Transwell小室的细胞数明显降低。下调LRP11后,两种宫颈癌细胞NC组、sh-LRP11组穿过Tranwell小室的细胞数分别为,SiHa细胞:212.3±13.0和170.2±14.2(p<0.01);CaSki细胞:147.6±14.5和76.8±12.0(p<0.001)。与阴性对照组相比,下调LRP11可显著抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。Western blot的检测结果显示,LRP11的下调可降低MMP-2、MMP-9、VEGF等蛋白的表达。然而,SiHa细胞下调LRP11后,MMP-2蛋白表达虽然降低,与NC组相比并无同统计学差异;LRP11组和NC组MMP-9/β-actin相对蛋白表达量分别为0.63±0.11和1.36±0.12(p<0.05)。CaSki细胞下调LRP11后,与NC组相比,VEGF蛋白(0.90±0.13 vs.1.48±0.10,p<0.05)和MMP-9蛋白(0.58±0.09vs.1.07±0.11,p<0.01)表达均明显降低。研究结论:1.下调宫颈癌细胞中LRP11的表达,可降低肿瘤细胞的增殖、侵袭能力。2.LRP11对宫颈癌细胞凋亡相关蛋白的表达及细胞凋亡率无明显影响。3.LRP11在宫颈癌的生物学进展中发挥重要作用。第三部分:LRP11影响宫颈癌细胞生长的体内研究及机制探讨研究目的:1.建立荷SiHa宫颈癌移植瘤裸鼠模型。2.检测LRP11表达对荷SiHa裸鼠移植瘤生长的影响。3.探讨LRP11表达对荷SiHa裸鼠移植瘤中LRP11、P16表达水平的影响。研究方法:1.培养宫颈癌SiHa细胞(sh-LRP11组、NC组),分别接种于体重大致相同的裸鼠皮下,每只裸鼠接种肿瘤细胞数为5×10~6个,每日观察裸鼠生存情况,检查肿瘤重量和体积变化,及时记录。2.种瘤5天后每3天测量移植瘤体积,肿瘤体积=(宽度)~2×长度/2,做好记录。种瘤41天后处死小鼠,剥离背部移植瘤,称重并记录。3.将剥离的移植瘤取等量制作石蜡切片,采用免疫组化法检测移植瘤组织中LRP11及P16的表达情况。研究结果:1.下调LRP11表达后,宫颈癌SiHa细胞体内生长的能力降低:将下调LRP11表达的慢病毒转染入宫颈癌SiHa细胞,并接种至裸鼠皮下,以NC组为对照。结果显示,接种41天内,sh-LRP11组肿瘤生长速度明显低于NC组(p<0.05);sh-LRP11组移植瘤的平均体积和重量均小于NC组(p<0.05)。2.LRP11的下调可降低体内宫颈癌细胞的P16表达:免疫组化法检测了经sh-LRP11转染后宫颈癌SiHa细胞中LRP11和P16表达的变化,结果显示,与NC组相比,sh-LRP11组LRP11表达降低(23.6±4.5 vs.44.8±7.1,p<0.05),P16表达也显著降低(18.4±3.9vs.77.7±9.2,p<0.05)。研究结论:1.下调宫颈癌中LRP11的表达,可抑制宫颈癌细胞的体内生长能力。2.LRP11的下调可降低体内宫颈癌细胞的P16表达。本研究的创新性1.LRP11在宫颈癌诊断及预后研究领域的创新:本课题首次研究了LRP11在宫颈癌中的表达水平及其与宫颈癌患者生存预后的关系,目前相关研究甚少,且多数研究仅涉及LRP1等LRP家族中其他分子,本研究有望填补研究空白,开发宫颈癌早期诊断的有效分子标志物。2.LRP11在宫颈癌生物学进展中作用的研究创新:本课题首次探讨了LRP11在体内外对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学功能的影响,目前LRP家族在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用,但在宫颈癌中的相关研究尚少。