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目的:发现与SIRT2相互作用的蛋白,研究SIRT2对热休克蛋白HSP90活性调节的机理,为进一步研究SIRT2介导的信号通路提供理论依据,并为深入研究SIRT2在调节细胞应激反应中的机制打下基础。方法:通过PCR等一系列手段构建SIRT2-p GEX-6P-1原核表达质粒,诱导GSTSIRT2融合蛋白表达并纯化该蛋白,利用pull-down技术筛选大鼠神经胶质瘤细胞中与SIRT2相互作用的蛋白,切取目的条带进行质谱鉴定,并用Western Blotting进行验证。同时,收集细胞,经RIPA裂解后与protein A/G beads及抗SIRT2的抗体低温孵育,做免疫共沉淀试验,进一步验证蛋白之间的相互作用。筛选效果较明显的SIRT2的si RNA,然后构建SIRT2过表达慢病毒载体和SIRT2干扰慢病毒载体,使用嘌呤霉素筛选出SIRT2稳定过表达和SIRT2稳定干扰的B104细胞株。培养整合有慢病毒的细胞,收集细胞,经RIPA裂解后与protein A/G beads及抗HSP90的抗体低温孵育,做免疫沉淀试验,检测SIRT2对HSP90去乙酰化的影响情况。以SIRT2-p IRES质粒为模板,PCR获得SIRT2基因的目的片段,通过胶回收、T载体克隆、T4 DNA连接酶连接等手段等将其插入真核表达载体p EGFP-C2中,使目的基因SIRT2能够和GFP融合同时表达。采用脂质体法转染293T细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的亚细胞定位;使用核浆分离方法和Western Blotting方法检测融合蛋白的亚细胞定位.加入出核抑制剂leptomycin B,进行同样的处理。结果:(1)成功构建SIRT2-p GEX-6P-1原核表达质粒(2)GST-SIRT2融合蛋白经IPTG诱导大量表达,并纯化得到该蛋白(3)通过pull-down实验及质谱鉴定,发现与SIRT2相互作用的蛋白分子(4)经免疫共沉淀实验证明SIRT2与HSP90确实存在相互作用(5)筛选得到效果明显的SIRT2的si RNA(6)构建成功SIRT2过表达的慢病毒载体和SIRT2干扰的慢病毒载体(7)筛选得到SIRT2稳定过表达和SIRT2稳定干扰的B104细胞株(8)经免疫沉淀实验检测,SIRT2过表达或抑制,HSP90乙酰化水平降低或升高(9)成功构建SIRT2-p EGFP-C2真核表达质粒(10)转染SIRT2-p EGFP-C2真核表达质粒后,在荧光显微镜下观察,发现SIRT2主要分布在细胞质中,在细胞核中几乎没有分布。加入出核抑制剂leptomycin B后,荧光显微镜下观察到SIRT2在核内有明显聚集,但是在细胞质中仍有分布,12h左右后,细胞质和细胞核的分布没有明显区别。撤去leptomycin B后,SIRT2还是主要分布在细胞质中,与未加leptomycin B时的情况基本一致。进一步通过核浆分离方法和Western Blotting方法进行检测:转染SIRT2-p EGFP-C2后,SIRT2主要在细胞质中表达,细胞核内几乎没有表达,加入leptomycin B后,SIRT2在细胞质中依旧表达很高,在核内的表达也明显升高,撤去leptomycin B后,SIRT2还是主要在细胞质中表达,与未加leptomycin B时的情况基本一致。结论:(1)SIRT2与HSP90存在相互作用(2)SIRT2去乙酰化HSP90(3)SIRT2主要定位在细胞质。SIRT2具有核质穿梭功能,它的亚细胞定位是个动态变化过程。