【摘 要】
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目的:研究Rho/ROCK信号通路对体外生精小管样结构重构的影响及相关分子机制,为明确男性不育的分子机制及其治疗提供理论基础。方法:1.睾丸细胞团培养:取10日龄C57/BL6小鼠睾丸酶解消化为单细胞悬液,重聚后添加人工合成血清替代物(Knock OutTM Serum Replacement,KSR)进行三维（3 dimensions,3D）立体培养;2.Rho/ROCK信号通路在生精小管样结构
【基金项目】
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国家自然科学基金（31660338）:TGFβ、Dhh信号轴对睾丸器官重构的作用及机制研究； 贵州省科技计划项目（黔科合基础[2016]116）；
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目的:研究Rho/ROCK信号通路对体外生精小管样结构重构的影响及相关分子机制,为明确男性不育的分子机制及其治疗提供理论基础。方法:1.睾丸细胞团培养:取10日龄C57/BL6小鼠睾丸酶解消化为单细胞悬液,重聚后添加人工合成血清替代物(Knock OutTM Serum Replacement,KSR)进行三维（3 dimensions,3D）立体培养;2.Rho/ROCK信号通路在生精小管样结构重构中的作用:添加ROCK分子抑制剂Y27632和Rho蛋白激动剂Bradykinin（BK）,将实验分为control组（阴性对照组）、KSR（阳性对照组）、KSR+Y27632组和BK组,利用免疫荧光技术检测支持细胞（Sertoli cells,SCs）、管周肌样细胞（Peritubular myoid cells,PTMs）、睾丸间质细胞（Leydig cells,LCs）、生殖细胞（Germ cells,GCs）定位情况及生精小管样结构重构情况;3.利用免疫荧光技术检测支持细胞、生殖细胞增殖情况;4.添加BK培养2周后观察紧密连接标志物Claudin11和ZO-1表达情况;5.Real-time PCR检测Rho GTPase、ROCK分子m RNA表达水平;6.Western Blot检测Rho/ROCK信号通路下游分子MLC/p-MLC蛋白表达水平;探讨Rho/ROCK信号通路在生精小管样结构重构中的作用及机制;7.分离提取10天小鼠睾丸支持细胞,培养3d后利用免疫荧光技术鉴定支持细胞纯度;8.将分离的支持细胞分为RPMI 1640组（cont组）、KSR组、FBS组、KSR+Y27632组、BK组,相差显微镜下观察Y27632和BK分别处理后Rho/ROCK信号通路对支持细胞管状结构形成的影响;9.对cont组和BK组标本进行转录组测序,并对其结果进行生物信息学分析寻找差异基因。利用显著上调的差异基因Cxcl5受体抑制剂进一步探讨Rho/ROCK信号通路对生精小管样结构形成的作用。结果:1.将立体培养的细胞团脱水包埋,行石蜡切片染色。免疫荧光结果显示,与阳性对照KSR组相比,添加ROCK激酶抑制剂Y27632后,支持细胞极性消失,管周肌样细胞由最初的线性、连续性排列变为圆形散在分布,睾丸间质细胞、生殖细胞、未分化型精原细胞、初级精母细胞零散分布,层粘连蛋白表达受抑。添加Rho GTPase激动剂BK后,支持细胞具有极性,管周肌样细胞位于支持细胞外侧排列呈线性,有睾丸索样结构形成。睾丸间质细胞位于生精小管样结构之间,未分化型精原细胞、初级精母细胞位于生精小管样结构基底部或管腔内,Laminin呈线性分泌;2.Y27632抑制支持细胞、生殖细胞增殖,p＜0.05;而BK能促进支持细胞、生殖细胞的增殖,p＜0.05,差异均有统计学意义;3.培养2周后发现与cont组相比,BK显著促进紧密连接蛋白ZO-1和Claudin11的表达;4.Real-time PCR结果显示:与阴性对照组相比,KSR组Rho GTPase m RNA表达明显增多,p＜0.05;与阳性对照KSR组相比,Y27632处理后,ROCK基因表达明显下降,p＜0.05;BK作用后,与阴性对照组相比Rho GTPase、ROCK基因表达水平升高,p＜0.05;差异均具有统计学意义;5.Western blot结果显示:与阳性对照组相比,抑制剂组p-MLC蛋白表达明显减少,p＜0.05;激动剂组与阴性对照组相比,p-MLC蛋白的表达增多,p＜0.05;差异具有统计学意义;6.Image J软件计数GATA4+DAPI+细胞数量占细胞总数的90%以上;7.相差显微镜下观察到与KSR组相比,FBS组未有生精小管样结构形成。添加Y27632后随着抑制剂浓度的增加,管状结构逐渐崩解;而BK处理后,与cont组相比有促进管状结构形成的趋势;8.运用qPCR技术对转录组结果进行验证,发现与对照组相比,BK处理后上调基因中有8个Cxcl5,Myl1,CKM,Hnrnpa3,Tnnt3,Tnni2,Mfsd4a,Myot等与细胞骨架重塑、细胞迁移有关（其中Cxcl5显著上调）;下调基因8个Rdh7,Cyp24a,Cyp3a11,Cyp2a5,Mup3,Mup22,Serpinald,Akr1c6等与性别发育相关。并且Cxcl5特异性受体CXCR2抑制剂SB225002抑制生精小管样结构的形成。结论:1.Rho/ROCK信号通路参与生精小管样结构重构;2.Rho/ROCK信号通路参与支持细胞管状结构的形成;3.Cxcl5/CXCR2可能通过与Rho/ROCK信号通路相互作用参与生精小管样结构重构。
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