研究背景临床危重症患者因病情重、病种多和免疫力低导致患者合并感染的发生率很高,又因卧床、有创机械通气等原因使得危重患者发生肺部感染的情况最为多见。通常对于危重患者较之普通患者的抗感染策略更全面、更强化也更为复杂,抗菌药物的选择及停用对于临床医生经常是比较棘手的问题,抗感染治疗后肺部感染的再发也是一大难题。论文前期对肺部感染再发的危险因素开展了临床研究,所获结果不仅对于医生做出更合理的抗感染临床决策有指导意义,还启发了从患者宿主防御角度开展危重肺病基础实验研究的思路。肺表面活性物质是由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的磷脂-蛋白混合物,肺表面活性蛋白(SP)是肺表面活性物质的重要组分,其中SP-D不仅对于降低肺泡表面张力有重要作用,SP-D同时也是宿主防卫蛋白,在肺的天然免疫中发挥重要作用。论文从SP-D基因缺陷小鼠动物模型入手,研究肺的病理状态和免疫改变,并对SP-D基因缺陷小鼠进行间充质干细胞来源的外泌体干预,探索能否为危重肺病提供肺修复的可能。研究目的1、通过SP-D基因缺陷小鼠模型,对肺组织病理学、肺内炎症小体、血清炎症因子和肺泡巨噬细胞等进行实验研究。2、探索能否应用间充质干细胞来源的外泌体来修复因SP-D基因缺陷所致的肺部病理及免疫改变。研究方法1、选择相同遗传背景(C57BL/6)的WT小鼠与SP-D KO小鼠为动物模型基础,将生长到6个月龄以上的SP-D KO小鼠作为主要研究对象。2、准备间充质干细胞来源的外泌体用以治疗动物模型,首先对间充质干细胞进行细胞培养及传代筛选,然后采用试剂盒法从间充质干细胞提取外泌体,并对提取的外泌体进行蛋白定量及透射电镜检测。3、应用间充质干细胞的外泌体干预SP-D KO小鼠,采用经鼻给药途径对小鼠进行不同剂量疗程的外泌体治疗,对经外泌体治疗的小鼠和未经治疗的小鼠进行分组,并根据研究需要对经过治疗的小鼠进一步分为不同治疗剂量的亚组。4、对各组小鼠分别给予留取下腔静脉血,进行肺泡灌洗或留取肺组织。5、对小鼠肺组织进行HE染色研究肺的组织病理学,比较经外泌体治疗的和未经治疗的小鼠肺的组织病理学改变。6、通过免疫荧光试验检测不同组别小鼠肺内NLRP3炎症小体的活化情况,同样的免疫荧光法检测不同组别小鼠肺内p-NF-κB p65的表达情况。7、ELISA法检测不同组别小鼠血清中炎症因子IL-6和IL-1β的表达情况。8、对肺泡灌洗液进行炎症细胞学研究,并尝试对肺泡巨噬细胞进行体外的吞噬实验。9、应用SigmaStat软件进行统计学分析,各组数据应用均数±标准差表示,组间比较应用t检验或ANOVA,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、小鼠的肺组织经过HE染色后,WT小鼠显示正常肺组织表现,6个月龄以上的SP-D KO小鼠显示出重度的肺气肿表现,外泌体治疗后的SP-D KO小鼠为轻度肺气肿表现。经过测量肺泡直径并进行统计,与未治疗组小鼠相比较,治疗组小鼠的单个独立肺泡直径较小,差异有统计学意义(P<0.05)。2、免疫荧光法检测肺内NLRP3炎症小体的结果显示,与WT小鼠相比SP-D KO小鼠肺内NLRP3的表达上调,然后将不同外泌体剂量的治疗亚组分别与未治疗组进行比较,发现随着治疗剂量增加到3个剂量和4个剂量,NLRP3的表达有下调趋势(P<0.05)。3、免疫荧光法检测肺内p-NF-κB p65的表达情况,结果显示与WT小鼠相比SP-D KO小鼠肺内p-NF-KB p65的表达上调,然后将不同外泌体剂量的治疗亚组分别与未治疗组进行比较,发现随着治疗剂量增加到3个剂量和4个剂量,p-NF-κB p65的表达有明显的下调趋势(P<0.01)。4、ELISA法检测各组小鼠血清IL-6和IL-1β的结果显示,WT组、SP-D KO治疗组和SP-D KO未治疗组的炎症因子表达量都处在较低水平。5、肺泡灌洗液炎症细胞学研究发现,经过外泌体治疗和未经过治疗的SP-D KO小鼠肺泡灌洗液中均以巨噬细胞和淋巴细胞为主,对每种炎症细胞的构成比进行组间比较,未见显著差异。肺泡巨噬细胞的吞噬实验可见巨噬细胞吞噬细菌现象。研究结论1、6个月龄以上的SP-D KO小鼠肺组织出现重度肺气肿表现,表明SP-D具有对肺泡的维持稳态作用。2、SP-D KO小鼠肺内NLRP3炎症小体和p-NF-κB p65均表达上调,表明SP-D对肺NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路的激活有抑制作用。3、经MSC外泌体治疗的SP-D KO小鼠肺组织为轻度肺气肿表现,表明MSC外泌体可在一定程度上修复SP-D基因缺陷小鼠的重度肺气肿病理状态。4、增加MSC外泌体治疗剂量,可以抑制SP-D KO小鼠肺NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路的激活。表明MSC外泌体干预可对SP-D基因缺陷小鼠肺的免疫改变起到某种程度的修复作用。