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目的1.培养大鼠骨髓源树突状细胞，研究应用腺病毒转染IL-10基因后树突状细胞的表型及功能变化。2.建立同种异体大鼠角膜穿透性移植模型，探讨IL-10基因修饰的未成熟树突状细胞在大鼠角膜移植排斥反应中的作用。方法1.通过利用大鼠淋巴细胞分离液及细胞因子诱生方法，提取大鼠骨髓源树突状细胞的前体细胞并进行培养。培养至第6天时将培养的细胞分为3组：第1组原条件继续培养至第12天，即12-DC组；第2组转染滴度为107的GFP-Adenovirus，继续培养至第12天，即GFP-DC组；第3组转染滴度为107的IL-10-GFP-Adenovirus，继续培养至第12天，即IL-10-GFP-DC组。利用流式细胞仪（FCM）检测3组树突状细胞特异性成熟标志CD83以及细胞表面共刺激分子CD86的表达；利用MTT方法比较3组树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力；利用台盼兰检测方法，检测细胞活性；利用Western Blot方法，检测IL-10蛋白的表达。2.将受体SD大鼠随机分为4组：阳性对照组、GFP-DC组、8-DC组及IL-10-GFP-DC组，分别于角膜移植术前3天尾静脉注射等量的PBS、供体Wistar大鼠骨髓源8-DC（培养8天的DC）、转染48h的GFP-DC及IL-10-GFP-DC，建立大鼠穿透性角膜移植模型。术后每天在裂隙灯下对角膜植片进行临床观察，记录排斥反应指数及角膜植片存活时间。大鼠角膜移植术后第14天行各组角膜组织的病理学检查及免疫组织化学检查。结果1.新提取的树突状细胞前体细胞呈圆形，细胞小，形状规则；培养到第2天时细胞体积开始增大，并呈现出集落生长；培养至第4天时，细胞体积继续增大，细胞集落也增大，很多细胞开始出现大小不规则、形状不一的突起；第6天，细胞体积进一步增大，细胞突起更为明显。随着培养时间的延长，细胞形态变化更加明显，并开始呈现树突状细胞形态；第12天可见细胞不规则，细胞表面出现粗细不等、长短不一的树枝状或毛刺状突起，呈现典型的树突状细胞的形态。流式细胞仪检测结果显示： IL-10-GFP-DC表面分子CD83，CD86表达为约16%，20%，较GFP-DC组（44%，42%）及12-DC组（45%，48%）表达水平低。MTT结果显示：IL-10-GFP-DC刺激同种异体T细胞增殖能力最弱，12-DC刺激同种异体T细胞增殖能力最强，差异具有显著的统计学意义（P<0.01）。台盼兰染色检测，显示细胞活性>98%。Western Blot检测，观察到IL-10-GFP-DC组出现IL-10蛋白特征性条带表达。2.阳性对照组、GFP-DC组、8-DC组及IL-10-GFP-DC组角膜植片的存活时间分别为：10.29±1.11d、19.14±1.34d、18.57±1.27d、25.86±1.07d，GFP-DC组、8-DC组、IL-10-GFP-DC组与阳性对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；IL-10-GFP-DC组角膜植片存活时间较GFP-DC组、8-DC组比较显著延长（P<0.01）；GFP-DC组与8-DC组比较无统计学意义（P>0.05）。术后第14天阳性对照组、GFP-DC组、8-DC组以及IL-10-GFP-DC组的排斥反应指数分别为：6.71±0.49、3.71±0.49、3.86±0.38、1.71±0.49，GFP-DC组、8-DC组、IL-10-GFP-DC组与阳性对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.01）；IL-10-GFP-DC组与8-DC组、GFP-DC组相比较，有统计学意义（P<0.01）；GFP-DC组与8-DC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。病理组织学检查结果显示，阳性对照组角膜植片明显增厚，基质层结构紊乱，植片中可见大量炎细胞浸润，并可见新生血管；GFP-DC组、8-DC组、IL-10-GFP-DC组角膜植片的炎症反应较阳性对照组轻，植片中央未见明显新生血管。免疫组织化学结果显示：IL-10-GFP-DC组的CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+阳性细胞数量较阳性对照组、GFP-DC组、8-DC组减少，阳性对照组角膜植片中CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+阳性细胞数量最多。结论1.应用细胞因子诱生方法，成功培养出大鼠骨髓源树突状细胞。转染IL-10基因后的树突状细胞分泌IL-10细胞因子，大鼠骨髓源树突状细胞表面成熟特异性标志CD83及共刺激分子CD86的表达水平最低，刺激T细胞增殖的能力弱，抑制树突状细胞的成熟。2.经过供体来源树未成熟突状细胞预处理的受体，角膜植片的存活时间显著延长，成功诱导角膜移植免疫耐受。CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+阳性细胞参与了同种异体角膜移植排斥反应的调控，IL-10-GFP-DC可降低CD4~+、CD8~+、CD25~+、IL-2~+、NK~+及NF-κB~+阳性细胞的浸润，抑制角膜移植排斥反应的发生。