酶是一类维持细胞正常生理活动的具有催化活性的蛋白质，其具备的特殊生物学活性在人的生理和代谢过程中发挥着重要作用。研究表明，某些酶的表达和功能上的异常与疾病的发生密切相关。现有的酶检测方法存在放射性标记、专业设备要求、灵敏度低以及体外检测等局限性。因此，建立新的分析方法，实现准确且高灵敏的表征复杂生物体系中目标酶的表达和功能在疾病诊断、药物筛选和精确治疗方面表现出重要的应用价值。本文结合DNAzyme、四面体DNA纳米结构和还原性氧化石墨烯(rGO)的优点，构建了两种信号放大生物传感器用于灵敏检测活细胞中的脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶1(APE1)和核糖核酸酶A(RNase A)活性。详细内容描述如下。
　　1.构建了一种DNAzyme修饰的四面体DNA纳米结构结合分子信标的纳米生物传感器用于APE1的灵敏检测和细胞内成像。
　　APE1因其在DNA修复和氧化还原调节中的关键作用，成为使肿瘤细胞对放化疗法敏感的新兴靶标。结合APE1对AP位点特异性识别水解的特点，该纳米生物传感器由DNAzyme修饰的四面体DNA纳米结构(DZ-TDN)、含AP位点的封闭链(AP-Locker)和嵌合rA碱基的分子信标(MB)三组分构成。在正常状态下，DNAzyme与AP-Locker杂交形成双链体后失活。加入APE1后，APE1对AP位点的水解可释放DNAzyme，恢复活性的DNAzyme进一步触发MB的循环裂解，实现信号放大。结果表明，该方法对APE1活性分析的线性响应范围为0.01到1U·mL-1，检测限为0.01U·mL-1。此外，该方法已成功的用于APE1抑制剂的筛选和细胞内成像。
　　2.构建了一种基于DNAzyme和rGO的纳米生物传感器用于RNaseA的灵敏检测和细胞内成像。
　　RNaseA作为一种核糖核酸内切酶在抗病毒、抗肿瘤等方面发挥重要作用。结合RNaseA对RNA碱基特异性切割的活性，该纳米生物传感器由含有rU碱基和DNAzyme序列的发夹探针、FAM标记并嵌入rA碱基的单链探针和纳米材料rGO四组分构成。在不存在RNaseA的情况下，单链探针的荧光由于rGO强烈的吸附作用而被淬灭。加入RNaseA后，RNaseA对发夹探针的识别和水解可使活性DNAzyme从发夹探针中释放。释放的DNAzyme可以在辅因子的帮助下触发单链探针的循环裂解并产生FAM标记的短片段，这些短片段不被rGO吸附。该方法的检测下限为0.1pg·μL-1RNaseA。此外，通过该方法筛选靶向RNaseA的天然药物，发现B6以浓度依赖性激活RNaseA的活性。细胞内实验显示该药物在不同细胞系中对RNaseA活性调节具有差异性。最后，该方法成功的用于RNaseA的胞内成像。
　　综上，我们所构建的基于DNAzyme的信号放大纳米生物传感器成功的实现了酶的准确检测和细胞内成像，这在药物筛选、癌症诊断和预后评估方面具有重要意义。