甜瓜果实发育相关四个基因家族的全基因组分析及CmERFII-9基因的功能研究

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本文从全局角度对与果实发育相关的基因家族进行系统发育分析,探究基因家族的起源、进化及潜在的功能分化;明确各家族成员的表达特性及相关蛋白的调控网络分析;利用瞬时表达方法对目的基因进行功能研究,为后续对果实发育成熟相关基因的深入功能解析提供了明确的、高效的选择方向。针对甜瓜果实发育相关的AP2/ERF、SBP-box、EIN3/EILs和14-3-3四个基因家族进行了全基因组分析,并进行了CmERFⅡ-9基因的功能研究,  主要结果如下:  (1)鉴定得到136条AP2/ERF家族蛋白序列,包括ERF家族蛋白119个(其中ERF亚家族蛋白64个、DREB亚家族蛋白55个)、AP2家族蛋白13个、RAV家族蛋白4个。ERF家族基因中有87个基因不具有内含子,其余32个基因含有1-8个数目不等的内含子。在第Ⅰ和Ⅹ组中发现发挥负调控作用的EAR基序;在第Ⅴ组成员的N-末端发现参与DNA结合及蛋白之间相互作用的Cys重复序列CX2CX4CX2~4C;在第Ⅰ组中存在富含Ser/Thr具有转录激活作用的基序。ERF亚家族基因在各组织中表达丰度由高至低依次是果实、愈伤组织、花、根、叶子、子叶、韧皮。基因CmERFⅢ-11在果实中的表达丰度高于其它组织。克隆得到CmERFⅡ-9基因的全长cDNA,成功构建目的基因的超表达载体pPZP221-CmERFⅡ-9和RNAi表达载体pART27-CmERFⅡ-9,在甜瓜果实中注射含有上述两种载体的农杆菌液后果实局部分别呈现提早成熟和推迟成熟表型,通过进一步对果实发育成熟相关基因的分析表明该基因在甜瓜的果实发育成熟过程中对ACO基因发挥正调控作用,推测对ACS、PDS、PFK、XTH和NCED基因发挥由于启动功能冗余基因表达而导致的负调控作用。  (2)鉴定得到13条SBP-box家族蛋白序列,分为4个独立亚族。SBP-box家族基因成员分别含有1-10个数目不等的内含子。SBP-box家族成员全部具有双锌指类结构,并且都具有高度保守的双向核定位信号区。SBP-box结构域在某些位置高度或绝对保守。全长序列比对发现SBP-box家族蛋白的N-端和C-端序列变异性较大。发现6条序列具有miRNA156靶位点。各组织中SBP-box家族基因的表达丰度由高至低依次为果实、根、花、愈伤组织、叶、子叶、韧皮,CmSBP11在果实中特异表达。  (3)鉴定得到4条EIN3/EILs家族蛋白序列,均含有1个内含子。甜瓜、拟南芥、番茄和黄瓜的EIN3/EILs结构域保守性极高,均含极端保守的连续氨基酸序列GPVYGI、WWK、LQD、TLG及若干不连续的极端保守的氨基酸。该家族基因在甜瓜与黄瓜间分化程度最小,但在黄瓜中不存在与CmEIL03对应的同源基因;在番茄中有一定程度的分化;与拟南芥分化程度最大。表达模式分析显示CmEIL01、CmEIL02、CmEIL04在不同发育时期的果实中均有表达,CmEIL04在成熟的果实中特异表达。根据拟南芥蛋白互作网络结果推测CmEIL01和CmEIL02可与多个ERF蛋白发生作用。  (4)鉴定得到9条14-3-3家族蛋白序列,分为ε类和非ε类2个亚族,ε类含5个基因,分别含有5或6个内含子;非ε类含4个基因,均含有3个内含子。ε类成员在N-端和C-端均具有较高的变异性,非ε类成员除N-端具有绝对保守的Met外,其余区段变异性较大,但同源性高于ε类成员。不同组织表达模式分析显示该家族基因在果实、根、花、叶均有表达,其中MELO3C003536、MELO3C003562、MELO3C011041、MELO3C011028、MELO3C018726在果实中均有表达。根据拟南芥蛋白网络互作结果推测8个甜瓜14-3-3蛋白以二聚体形式共调控靶蛋白的活性。
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