利用双光子技术,在激光共聚焦显微镜下可以将样品在双光子激发后发出的荧光对活体生物体内的组织和细胞的纵向深度、精确的成像,比传统的单光子技术优势明显,将其应用于对粘度、活性氧、pH、温度等环境敏感因素的探测,以及对核酸、蛋白等生物分子的荧光标记已成为关注的焦点。本论文主要针对基于分子内电荷转移的以咔唑、吩噻嗪为母体染料的合成与相关生物应用的研究。在细胞内,粘度对物质流动,信号的传递,生物大分子间的相互作用以及活性代谢产物(如ROS和RNS)的扩散有着重要影响。因此,开发性能优良的可视化双光子荧光粘度探针有着重要的意义。本论文基于咔唑为母体设计并合成了四个二甲川半菁染料KQ、Caz-Cy2、Qcaz-Cy2和Pcaz-Cy2,它们的荧光发射峰在600nm左右的红色光区,这几种染料具有本底荧光弱、量子产率小于0.1的特点。其中着重研究了染料Caz-Cy2和Qcaz-Cy2,这两种染料各有两组吸收和荧光发射峰,荧光量子产率低而且受溶剂极性影响很小,但随着粘度的增加,短波长和长波长发射峰以不同的速率增强,呈现比例变化。本工作利用双光子比例的方法将染料Caz-Cy2和Qcaz-Cy2应用于对微生物粘度的检测中,随着粘度越大,双光子截面积增大了约20倍,并且探针Caz-Cy2和Qcaz-Cy2实现了在Hela细胞线粒体中和活体组织中的双光子比例荧光显微镜成像,与商业化染料的复染作对比,进一步确定了染料定位于线粒体中,并且可以在组织在深度为60-130μm范围内清晰成像。在人体生理活动过程中,活性氧(ROS)有着非常重要的地位,研究活性氧的生物相关机制是很有意义的。然而,对检测活性氧作用机制的研究最重要的一个障碍是缺少一种合适的方法在体内对活性氧进行检测。基于以上所面临的困难,本论文在双光子荧光探针的基础上,开发了两个以吩噻嗪为母体的二甲川半菁染料PTE-Cy2和PCE-Cy2,分子内的硫原子和π共轭双键活性高,易于与活性氧反应。染料PTE-Cy2可以用于检测高活性氧(hROS),染料PCE-Cy2活性较低,只能与羟基自由基反应。PTE-Cy2和PCE-Cy2进行了与活性氧反应后生成的鉴定,产物通过质谱、高效液相色谱和核磁表征。光谱中表现出吸收比例变化,而且在λem为470nm和595nm出现双波段荧光发射,这表明能实现一个比色和比率的变化过程。染料PCE-Cy2与羟基自由基反应后只生成染料POCE-Cy2,染料POCE-Cy2在高粘度条件下双光子截面积增大,在双光子组织成像中,可以在组织深度为60-130μm范围内清晰成像。PTE-Cy2和PCE-Cy2结构非常类似,都属于脂溶性分子且带有正电荷,所生成的荧光染料在长时间的染色中并未游离出线粒体,表明探针可对线粒体内的活性氧物种识别。基于咔唑和吩噻嗪高电子密度的特点,通过乙炔基和乙烯基将萘酰亚胺和具有吸电子特性的三联吡啶基团相连,设计合成了六个染料。其中CaNP和CaTNP为淬灭型Zn2+离子和Cd2+离子双光子探针,NSPA-Zn和NSPOA-Zn为自组装后的焦磷酸探针。其中NSPA-Zn对焦磷酸结合后在λem为475nm和605nm处呈现双波段荧光增强,双光子有效吸收截面积由28GM增加到175GM,对焦磷酸识别选择性好,无其他阴离子的干扰。NSPOA-Zn为ICT机理的荧光探针,与焦磷酸结合后,Zn2+离子与三联吡啶的结合力被消弱,ICT过程降低,λem在605nm处荧光逐渐降低,λem在475nm处的荧光发射逐渐增强,最大双光子吸收截面积由810nm处的210GM增加至730nm处的358GM。NSPA和NSPOA可在在活细胞内通过双光子荧光显微镜对锌离子选择性荧光成像,但当加入焦磷酸后又恢复到初始荧光。