解旋酶普遍存在于真核生物、原核生物以及病毒体内,其功能涉及核酸代谢的各个途径,并参与介导多种细胞应激反应,其中包括细胞凋亡、衰老和自噬等,帮助细胞应对复制错误和内源性或外源性诱导的DNA损伤。此外,解旋酶途径出现缺陷将导致机体和组织的衰老以及神经系统缺陷等一系列问题。Pif1作为ATP依赖性的SF1B解旋酶,由于其在酵母中维持线粒体DNA稳定性所发挥的重要作用而被首次发现,目前所有真核生物和某些细菌中均存在Pif1解旋酶。已有多项研究报道,Pif1解旋酶参与各种重要的细胞生理活动,包括冈崎片段的成熟,核糖体和线粒体DNA的复制以及端粒调节等。此外,在富含鸟嘌呤序列的染色体区极易形成G-四链体（G4）结构,而G4结构的高度稳定性使其成为复制阻碍及DNA断裂损伤的关键因素,有研究表明,Pif1可与G4结构紧密结合,并且相比于其他解旋酶,Pif1具有更高的特异性识别和解旋G4的能力,因此针对G4结构的Pif1解旋酶将在细胞中扮演着重要角色。多项研究表明,Pif1解旋酶可由DNA诱导形成二聚体,但是二聚体结构信息的缺失导致我们无法明确二聚化对于Pif1解旋活性的调节机制。因此,本文选择原核生物中的嗜热菌Pif1（Themus oshimai Pif1,简称ToPif1）进行结构和生化的研究,旨在通过单晶衍射、小角散射技术由原子水平揭示ToPif1解旋酶二聚化的结构和机理基础,同时结合空间排阻色谱法、基于动态激光的散射技术对溶液状态下蛋白的聚集状态进行表征,进一步利用基于共振荧光能量传递机理的快速停流追踪检测技术以及单分子荧光共振能量转移方法对二聚化Pif1解旋酶动力学机制进行系统性的阐释,目前已获得了以下几项研究结果:1.首次解析了ToPif1单蛋白的结构、与粘性末端双链DNA复合的单体结构,以及与单链DNA复合的二聚体结构,从而得到了不同状态下的ToPif1蛋白结构信息。2.从结构域的组成和整体折叠方式而言,ToPif1蛋白的单体结构与Bs Pif1（PDB号:5FTD）、Ba Pif1（PDB号:5FHG）以及h Pif1（PDB号:6HPU）高度相似,并且其结构域2B与1A、2A之间的相互作用使得ToPif1蛋白处于闭合状态,从而封闭了单链DNA结合位点,我们通过分子内交联实验进一步证明了闭合状态的ToPif1蛋白无解旋活性。3.粘性末端双链DNA的结合导致ToPif1蛋白的结构域2B由闭合转至开放构象,但是由于双链部分的电子密度较弱,导致未能解析出双链DNA的结构,因此我们结合小角散射数据补充了双链DNA的完整模型,并进一步采用荧光标记蛋白从单分子水平上揭示了ToPif1潜在的双链解旋机制:与其他SF1A解旋酶利用闭合或开放构象进行解旋的机制不同,ToPif1的解旋机制依赖于其结构域2B在闭合与开放构象之间的来回摆动。4.通过晶体结构的对比分析,发现单链DNA的结合不仅使ToPif1蛋白的构象进一步打开,且分子之间形成的二聚体相互作用也将蛋白锁定在该状态中。为此,我们提出二聚化对于蛋白解旋活性的负调控机制,并证明了溶液状态下由DNA诱导的ToPif1二聚体的存在及其对于解旋酶活力的抑制作用。总之,本论文从结构和活性这两方面详细揭示了ToPif1的解旋机理和二聚化的负调控机制,并由结构分析和突变体的结果表明,2B结构域的构象变化对于Pif1解旋酶的酶促活性至关重要。本论文提出的结构机理可以作为研究二聚化如何影响/调节DNA复制,重组和修复的新方向,为了解二聚体调控的潜在生理学意义提供结构基础和新的启示,从而有助于人们更深入地研究SF1B解旋酶的功能。