论文部分内容阅读
肠炎沙门氏菌（salmonella enteritidis）是一种兼性胞内寄生菌,能引起人和各种动物的沙门氏菌病,主要表现为胃肠炎和败血症,是人类食物中毒的主要病原菌之一。肠炎沙门氏菌主要通过沙门氏菌毒力岛（Salmonella Pathogenicity Island,SPI）发挥致病作用,毒力基因ssr AB作为SPI-2上的双组份调控系统,对肠炎沙门氏菌在宿主细胞的定植起重要作用。免疫接种是预防沙门氏菌病最有效的方法,相对于灭活疫苗,弱毒活疫苗对于预防肠炎沙门氏菌在肠道的定植及系统性感染方面具有更好的效果。与传统方法致弱的活疫苗相比,沙门氏菌基因工程减毒活疫苗不仅能更有效地激发宿主的体液免疫和细胞免疫,而且具有突变特性稳定、不易发生毒力返强等优点。本研究在前期利用基因工程技术将宠物犬源肠炎沙门氏菌G9（亲本株）成功构建的1株ssr AB基因缺失减毒株（G9Δssr AB）的基础上,进一步开展生物安全性和免疫原性、免疫保护力的评价研究,从而为该基因缺失减毒株在免疫预防肠炎沙门氏菌病/感染中的应用提供科学依据。本研究利用构建的肠炎沙门氏菌基因缺失减毒株G9Δssr AB,以昆明小鼠为实验动物模型,进行如下研究:第一,利用口服接种的方法接种不同剂量的G9Δssr AB,并采用间接ELISA方法测定血清Ig G抗体效价,结合小鼠存活率确定G9Δssr AB的最佳免疫剂量。第二,将G9Δssr AB在LB液体培养基上连续传代至第30代,每5代利用PCR方法鉴定并测序验证,进行体外遗传稳定性试验。第三,对接种G9Δssr AB及其亲本株G9后小鼠的肝脏、脾脏、小肠定期无菌采样、称重、研磨、匀浆、梯度稀释后,采用倾注平板法接种至沙门氏菌显色培养基上进行菌落计数,测定G9Δssr AB及G9在小鼠体内的定植清除效率。第四,采用间接ELISA方法测定G9Δssr AB免疫后小鼠外周血Ig G及肠道粘膜Ig A抗体水平,5种细胞因子水平（IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1）,利用MTT法测定脾淋巴细胞增殖指数,利用流式细胞术测定外周血中CD4+、CD8+T细胞亚群百分比。第五,通过免疫攻毒试验,测定G9Δssr AB对肠炎沙门氏菌的免疫保护力以及对鼠伤寒沙门氏菌的交叉保护力,并取攻毒后小鼠的肝脏、脾脏、小肠制作病理组织切片观察病理变化。综合评价G9Δssr AB的生物安全性、免疫原性及免疫保护力。结果显示:G9Δssr AB口服免疫小鼠的最佳免疫剂量为5.0×107CFU;G9Δssr AB体外连续传代30代能够稳定遗传;与亲本株G9相比G9Δssr AB在小鼠体内能够更快的清除,在接种后12天基本清除其体内定植的G9Δssr AB;以5.0×107CFU/0.2m L/只的G9Δssr AB免疫小鼠并在两周后以相同剂量加强免疫,一免一周、一免二周、二免一周、二免二周的Ig G抗体效价分别为1:800、1:1600、1:12800、1:51200;与亲本株G9相比G9Δssr AB诱导机体产生的5种细胞因子水平（IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1）、肠道粘膜分泌型Ig A抗体水平、脾淋巴细胞增殖指数、CD4+与CD8+T细胞亚群百分比均无显著差异（P>0.05）,且与对照组相比差异显著（P<0.05）;以10倍LD50剂量的G9攻毒,攻毒保护率为90%,攻毒后小鼠肝脏、脾脏、小肠无明显病理变化,以10倍LD50剂量的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50115攻毒,攻毒保护率为60%。结果表明:G9Δssr AB符合研制肠炎沙门氏菌病/感染活疫苗的菌株生物安全性要求,具有良好的免疫原性、免疫保护力及交叉免疫保护力,具有在制备肠炎沙门氏菌基因工程减毒活疫苗中的应用前景。