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获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒HTV感染导致的严重危害人类生命健康的疾病之一。目前仍未有有效的治疗疫苗。本文使用生物信息学方法对中国流行的HIV-1序列进行了辅助受体嗜性分析,以及对所有的HIV-1序列进行ACA和UAH位点分析,同时也对HCV流行亚型做了ACA和UAH位点分析。另外,本文还对HIV-1荧光实时定量RT-PCR方法的建立进行了初步研究。主要结果如下:
1.使用R5X4-pred软件,对中国流行的HIV-1V3序列进行辅助受体预测分析发现,几乎所有的C亚型、CRF07_BC和CRF08_BC重组型病毒株都是R5型,B亚型和CRF01_AE重组型中也分别有62.6％和59.1％是R5型,表明R5比X4型更加流行。在不同的流行年份中,R5型始终保持稳定的流行趋势。另外我们也发现HIV-1的辅助受体嗜性与不同亚型有关,与传播途径无关。进一步分析发现,C亚型、CRF07_BC和CRF08_BC重组型病毒株的V3区序列比B亚型和CRF01_AE重组型V3区序列有更好的基因同源性。这些发现表明CCR5拮抗剂可能为未来中国AIDS治疗提供帮助,R5型病毒株对于AIDS疫苗的研究也很有价值。
2.细菌MazF和PemK分别能特异性剪切单链RNA中ACA和UAH位点,具有应用于AIDS基因治疗的潜在价值。为分析HIV—1和HCV基因组中这2个酶的酶切位点,我们从HIV Databases和HCV Databases下载了HIV-1和HCV各亚型的基因组序列,使用Notepad软件统计其中ACA位点数目、UAH位点数目以及组成UAH的UAC、UAA和UAU位点数目,并用Excel软件对它们出现的概率进行比较。发现除少数亚型(包括D、F和G)的vpu基因中ACA位点及J亚型的nef基因中UAU位点出现概率较低外,其它HTV-1基因中ACA位点和UAH位点出现概率相差不大,没有偏高或偏低的异常现象。在HCV分析中,除1a和1b的p7基因中ACA较低以及1a中NS4A较低外,ACA和UAH位点出现的概率也相差不大。这为MazF和PemK提供了良好的特异性剪切条件。另有研究表明,利用MazEF毒素-抗毒素系统构建的方法在体外能有效的剪切HIV-1 RNA上的ACA位点,阻断蛋白的合成,抑制HIV-1病毒的增殖,达到治疗的目的。我们的结果表明,各亚型HTV-1和HCV基因组中具有大量MzaF和PemIK的酶切位点,因此,这2个毒素蛋白可以用于AIDS和丙型肝炎的基因治疗。
3.对中国流行的所有亚型和重组型HIV毒株进行序列分析,在gag区设计一对能有效扩增约196bp片段的引物。通过RT-PCR扩增、TA克隆后制成标准品。通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,绘制了标准曲线,初步完成HIV-1核酸定量测定方法的建立。