论文部分内容阅读
导致人类疾病的病原体在不断进化,人类生产方式和生活环境的巨大演变也加速着这一进化过程。新病毒以及新型疾病的出现给人类生命健康和传统疾病治疗手段带来了前所未有的挑战,如2003年在亚洲急剧流行的严重急性呼吸道综合症(SARS)、2009年席卷全球的甲型流感病毒(H1N1、H5N1)和2005年新发现的细小病毒科人博卡病毒(HBoV)等。在众多威胁人类健康的疾病之中,恶性肿瘤(又称癌症)依旧占据着主要地位,并且尚无切实可行的治疗方法。寻找可行的癌症治疗手段和方法,已经引起了医学界和科学界的密切关注,人们不断探索着一些新的治疗方法。相对于传统癌症治疗手段(化疗、放疗)所带来的严重副反应特性,近年来出现的生物纳米技术在癌症治疗方面展现出了巨大潜力和优势。纳米生物技术是运用一些纳米颗粒或类似于纳米颗粒的生物材料(如病毒样颗粒)作为载体平台,来实现对病变等非正常细胞的特异性进攻,以达到治疗疾病的目的。目前,有关病毒样颗粒在细胞内或生物机体内的转运途径与机制、病毒样颗粒体外去组装与重组装、生物效应分子的偶联与包被等特性尚不够清楚。本研究基于已有有关细小病毒的研究,体外构建家蚕浓核病毒伊那株(BmDNV-1)结构蛋白基因vp4与增强型绿色荧光蛋白egfp基因融合表达载体,利用重组杆状病毒真核表达系统,制备荧光病毒样颗粒(fluorescent virus-like particle, fVLP)。得到的荧光病毒样颗粒因携带有绿色荧光蛋白标记,可以方便地用于其入胞、转运、定位以及体外自组装等生物学特性研究,为有关癌症治疗药物的研发提供参考。另外,以人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV-1)结构蛋白VP2为研究对象,构建VP2原核表达载体,亲和纯化VP2蛋白,用于多克隆抗体制备,用于人博卡病毒的快速检测和病毒蛋白亚细胞定位研究。完成的工作包括以下几个方面：1.制备家蚕浓核病毒结构蛋白VP4与EGFP融合表达的荧光病毒样颗粒1)PCR分别体外扩增家蚕浓核病毒结构蛋白基因vp4和绿色荧光蛋白egfp基因,通过酶切、连接和转化等步骤筛选重组克隆。将重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac,在协助质粒的帮助下,构建含结构基因vp4和egfp基因融合表达的重组Bacmid。2)重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞表达产生重组杆状病毒,获得重组杆状病毒病毒液。以最适感染复数的病毒液感染hi5细胞以表达荧光病毒样颗粒EGFP-VP4fVLP,然后利用蔗糖垫层及CsCl梯度离心获得较纯净的fVLP,电镜观察。2.表达并纯化HBoV-1结构蛋白VP21)PCR扩增HBoV结构蛋白基因vp2,并将其分别连接到pET-28a(+)和pMAL-c2x原核表达载体上,获得原核表达重组质粒pET-28a(+)-VP2和pMAL-c2x-VP2,将重组质粒分别转入相应表达宿主菌,检测目的蛋白VP2表达情况。2)将不同分子伴侣导入重组表达菌,检测目的蛋白的可溶性及表达情况,利用亲和树脂纯化VP2蛋白,纯化获得的VP2蛋白应用于多克隆抗体的制备。