研究背景骨科术后植入物部位感染是最常见的并发症之一,文献报道,骨折内固定与人假体置换后的感染率分别为5%-20%和0.5%-2%[1],植入物感染不仅导致患者术后功能恢复较差,而且延长了患者的住院时间,增加了住院花费及再入院率。虽然目前无菌操作及抗生素的应用及不断发展,植入物周围感染仍然面临着严峻的考验。目前研究[2]表明：内固定物周围一旦感染,细菌粘附在材料表面或骨与材料界面定植会引发感染的持续存在,一旦细菌定植之后,会在材料表面形成一层生物膜,这层生物膜可以防止细菌免于人类防御系统的攻击,因此,传统的全身抗生素应用很难治愈这种植入物周围的感染,唯一有效的治疗方法是取出植入物彻底清创,最终导致内固定稳定丧失给患者造成更大的痛苦和经济负担[3]。因此,研究和开发一种新型抗菌骨科植入材料已经成为当务之急。镁作为一种新型的生物可降解金属材料,具有较高的比强度和比刚度,适宜的密度及力学性能,并且比传统植入材料更加接近骨骼的弹性模量,能避免二次手术及有效缓解应力遮挡效应等优点[4],具有广泛的医用价值。但由于镁在机体内降解速率过快,难以维持稳固效果,并在腐蚀过程中产生大量的氢气,导致其临床应用受限[5]。合金化可显著提高镁合金的耐蚀性能,是目前医用镁合金应用研究的重点[6],但一些元素对人体是有害的[7],如铝对神经元有害,与痴呆、阿尔兹海默病有关；镨、铈、钇等稀土元素有肝毒性,锆和铈有细胞毒性,锂有潜在的致畸作用。基于北京大学工学院郑玉峰教授前期大量的体内、体外研究数据表明,镁钙合金(Mg-1.0wt%Ca alloy)具有良好的生物相容性和良好的抗腐蚀性能,是较为理想的镁合金材料,但其动物实验表明,由于其降解速率仍然较快,无法维持足够时长的机械强度。锶元素是人体必需的、无毒性的微量元素之一,可促进成骨细胞增殖、分化和抑制破骨细胞活性,并且可以明显改善镁的晶粒大小从而提高其耐腐蚀性能[8,9]。此外,有关文献[9]表明：适量比例的Ca和Sr元素加入纯镁中可以很好的改善镁晶粒大小从而提高整体的机械性能,Berglund等[10]证实：三元镁合金中,Mg-1.0Ca-0.5Sr显示出最佳的抗腐蚀性能,与Mg-1.0Ca相比,有着更加优越的耐腐蚀性及机械性能,而且具有良好的生物相容性。目前镁合金研究大都集中材料性能及生物成骨性上。然而,面对临床上骨科内固定植入物感染日趋严峻的形势,研究和开发具有抗菌性能的可降解镁合金植入材料具有很实际的意义。锌是人体必需微量元素之一,在机体内几乎参与所有生理代谢过程,锌除了在多种金属酶、转录因子及其他蛋白中起着催化或构建作用外,还以神经递质或调质样的形式发挥其功能[11,12]。与此同时,有关研究[12,13]表明锌具有良好的抗菌性能,而且同时能够促进成骨和提高合金耐腐蚀性能和机械强度。因而,我们提出将微量的锌元素添加到三元Mg-1Ca-0.5Sr合金材料中,设计出四种新型的Mg-1 Ca-0.5Sr-xwt.%Zn (x=0,2,4,6)四元合金材料,希望既能提高合金的耐腐蚀性能,又能发挥良好的抗菌性能。研究目的体外条件下观察四种新型镁合金材料对细胞生长、增殖及活力的影响,初步评价材料生物学性能,验证其作为一种新型医用可降解金属材料的安全性及有效性,随后通过直接和间接抗菌法探讨四种镁合金体外抗菌性能,为后期动物实验及临床应用提供依据。研究方法1.材料的表征：通过电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)分析不同镁合金材料的化学组成,并测定浸提液中离子溶度；通过扫描电镜观察材料的表面形貌;能谱分析仪及X线衍射仪检测材料晶界的组成及化学成分；通过pHmeter (Sartorius, PB-10)和Micro-Sample Osmometer (Fiske 210)分别测定Hank’s液和PBS缓冲液材料浸提液的pH值及渗透压；通过自制设备测定Hank’s液中四种镁合金材料氢气释放率,综合评价和比较四种镁合金材料耐腐蚀性能及机械性能。2.生物相容性试验：按照IS010993-12标准(试样表面积/浸体介质=1.25cm2/ml)分别制备四种镁合金浸提液,空白对照组(Ti-6A1-4V)采用含10%FBS的a-MEM培养基浸提,进行培养细胞。倒置显微镜观察各种浸提液培养的细胞形态；采用LDH实验评价四种镁合金材料对细胞的毒性；MTT法检测四种材料对细胞相对增殖率的影响；钙黄绿素染色评价不同材料浸提液对活/死细胞比例的影响,根据上述结果综合评价四种镁合金材料的生物细胞安全性,并进行对比分析。3.抗菌性能：采用间接接触抗菌法法评价四种镁合金材料浸提液对金黄色葡萄球菌的抗菌性能,并根据不同时段浸提液对细菌活性的影响绘制抗菌曲线；直接接触抗菌法直接评价材料对金黄色葡萄球菌的抗菌性能；细菌钙黄绿素/PI染色法观察不同镁合金材料表面活/死细菌数目；DAPI染色法及电镜评价不同材料表面细菌粘附性能及数目、形态的差异,综合评估和对比四种镁合金材料对金黄色葡萄球菌的抗菌性能。4.研究结果1.1.材料的表征1.1.1 通过ICP-AES分析得出四种材料的成分和元素含量基本为Mg-1.0wt%-0.5Sr-x wt.%Zn(x=0,2,4,6)四种合金材料,与我们理想设计时的基本一致；相对于Mg-1Ca-0.5Sr浸提液中,含Zn镁合金组浸提液中镁离子较高并且随着Zn离子溶度呈正相关；各组材料浸提液中钙离子溶度基本相同；Mg-1Ca-0.5Sr-4Zn中锶离子溶度最高,其他几组浸提液中锶离子溶度基本相同；锌离子溶度与材料中锌含量呈梯度增加。1.1.2 电子扫描电镜显示随着镁合金中锌元素含量的不断增加,合金的晶粒不断细化,合金的晶界不断从断续状向连续的网状变化,且合金的晶界同时会发生粗化形成片状化现象。能谱分析仪可见镁钙锶锌合金的晶界内由大量的Ca和Zn组成,说明钙锌主要以以第二相的形式存在于晶界内。1.1.3 XRD分析仪得出四种镁合金主要由Mg2Ca,CaZn3,Ca2Mg5Zn13,Ca2Mg6 Zn3, Ca2Mg6Zn3,Mg17Sr2。随着Zn含量的增加,第二相中Ca2Mg6Zn3的含量也随之增多。1.1.4 pH分析仪及Micro-Sample Osmometer (Fiske 210)检测其浸提液的pH值和渗透压结果：Hank’s液中,随着浸泡时间的延长,四组镁钙锶锌合金浸提液pH值随着浸提时间的增加逐渐升高,含锌的三种镁合金浸提液pH最后趋于平衡(pH值均在8.75-10.75),而在整个浸泡实验中Mg-1Ca-0.5Sr合金材料浸提液组pH始终呈上升趋势,未见明显平稳趋势。四种材料PBS浸提液,稀释后用于抗菌实验的共培养液,除了Mg-1Ca-0.5Sr组pH有统计学差异外,其他组pH和渗透压没有明显的统计学差异,但各组数值均在维持细菌活性的理想范围内。1.1.5 浸泡实验和释氢实验表明：添加锌后的镁合金材料的耐腐蚀性能和机械性能都有所提高。1.2材料的生物相容性1.2.1 LDH细胞活力检测结果显示：与对照组相比,不同含锌量的镁合金材料组浸提液与MC3T3-E1细胞共培养24h后,细胞活力未见明显差异。1.2.2 MTT结果显示,与对照组相比,四种镁合金材料浸提液组与MC3T3-E1细胞共同培养2、4天后,各组之间未见明显差异,符合0级标准；培养6天后,四种镁合金材料组细胞增值率有所下降,Mg-1Ca-0.5Sr-6Zn、Mg-1Ca-0.5Sr与对照组间显示出统计学差异,但各组毒性都处于0-1级之间。1.2.3 钙黄率素染色后倒置荧光显微镜下观察四种材料浸提液培养的细胞,贴壁良好,呈正常生长,细胞形态呈梭形,未见明显细胞溶解及红染死细胞等。1.3材料抗菌性能1.3.1 不同时间点材料浸提液与细菌共培养24小时后涂板结果发现,随着浸提时间的增加,含Zn镁合金材料的抗菌性能逐渐增强。72小时后共培养液中,含Zn的镁合金材料的抗菌率基本接近100%,其中抗菌性能的强弱与镁合金中Zn含量呈正相关。不含Zn镁合金材料组也显示出微弱的抗菌性能,但是整个过程中抗菌性能未见明显变化。1.3.2 材料与细菌共培养6小时后24小时涂板结果显示：四种镁合金材料表面对细菌皆有很强的抗菌性能;钙黄绿素染色结果显示：共培养液中镁合金材料表面的细菌几乎死亡；DAPI实验表明：材料表面对细菌的抗粘附性与时间和Zn含量呈正相关;电镜结果表明：与材料共培养后细菌形态几乎没有改变,但数目相对于对照组明显下降。结论1.四种镁合金材料均由Mg2Ca,CaZn3,Ca2Mg5Zn13,Ca2Mg6 Zn3,Ca2Mg6Zn3,Mg17Sr这些化合物组成,但随着材料中Zn含量的增加,其Ca2Mg6Zn3的含量逐渐增加,材料表面的晶粒大小明显细化；2.与三元Mg-1Ca-0.5Sr相比,含Zn镁合金材料组抗腐蚀性能得到明显提高；3.四种镁合金材料皆可通过细胞毒性评价,具有良好的生物相容性；4.四种镁合金材料皆具有明显的抗菌性能,其中含锌镁合金显示出更强的抗菌性能并且与锌含量呈正相关。5.该系类新型镁钙锶锌合金体内试验本课题尚未涉及,因而其能否成为一种新型可降解抗菌内植入材料有待后期实验进一步验证。