雷公藤甲素是各种雷公藤制剂的主要活性成分之一,其相关效价比雷公藤总苷高100～200倍。在发挥强大免疫抑制作用的同时,雷公藤甲素也是雷公藤起毒性作用的主要组成成分,从而在一定程度上限制了它的临床应用,尤其是系统给药途径。因此,雷公藤甲素外用给药成为扩大在皮肤科临床应用的理想选择。醇质体是近年来药物传递系统中一种新的脂质体载体,它的物理化学特性使它能更有效地运送药物通过角质层到达皮肤更深层。研究雷公藤甲素醇质体的体外透皮效果及在体抗炎疗效,为本课题研究目的之一。同时将不同浓度的雷公藤甲素作用于体外培养的ECV304细胞株,观测雷公藤甲素对ECV304细胞增殖抑制效应及其对细胞株端粒酶活性的影响,探讨雷公藤甲素对血管生成的抑制作用,为本课题研究目的之二。课题目的1、本研究以制备雷公藤甲素醇质体为研究切入点,以期充分发挥雷公藤甲素的生物活性,而降低药物毒副作用,扩大其在皮肤科的应用,同时为临床上皮肤科外用制剂研发提供新思路。2、为了科学的评价雷公藤甲素醇质体药效可能的机制。本研究采用Franz扩散池检测体外透皮效果,采用反射分光光度仪检测雷公藤甲素醇质体在体抗炎作用,为该药的外用制剂临床研究提供科学的数据。3、为评价雷公藤甲素醇质体活性,将不同浓度的雷公藤甲素分别地作用于体外培养的ECV304细胞株,观察对ECV304细胞株的抑制增殖效应、诱导细胞凋亡作用以及其对细胞株端粒酶活性的影响。试验方法1、醇质体的制备:醇质体制备采用薄膜水化法与超声法结合成改良的新方法。2、醇质体粒径分析:采用激光动态散射仪检测醇质体粒径进行分析,测定五个不同批次的醇质体,计算平均粒径。3、醇质体的包封率(EE%):雷公藤甲素醇质体采用超速离心法分离未包封的部分,药物含量采用HPLC检测。4、体外大鼠皮肤透皮实验:大鼠脱毛后获得皮肤标本,分离角质层和有活力的表皮(SCE)用于透皮实验,透皮研究使用Franz扩散池。5、药物的HPLC检测:HPLC分析均在室温下进行,烟酸甲酯检测波长为218nm,雷公藤甲素的检测波长为219nm。6、醇质体制剂的大鼠在体抗炎活性:采用反射分光光度仪检测在体抗炎作用。7、ECV304细胞株抑制率测定:采用四甲基偶氮唑盐比色试验法(MTT)检测。8、凋亡细胞的形态学观察:采用倒置显微镜进行观察。9、端粒酶活性检测:TRAP-ELISA法,具体使用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA端粒酶活性检测试剂盒进行端粒酶活性的检测。实验结果1、本研究结果发现醇质体的粒径随乙醇浓度增加而下降,随磷脂浓度增加而增加。乙醇和磷脂量对载体的包封率有正影响,即乙醇和磷脂的量越高,醇质体中包封的雷公藤甲素越多。雷公藤甲素是脂溶性药物,通常脂溶性药物的醇质体包封率相对比较高。本试验中发现在卵磷脂3%(v/v)、乙醇为30(v/v)配比下,制备的醇质体制剂(179.4±28.9nm)粒径最大,而在卵磷脂1-2%(v/v)、乙醇为45(v/v)配比下,制剂粒径最小(50 nm左右),雷公藤甲素醇质体中药物包封率均超过了85%。最优化处方的选择采用粒径、包封率为指标进行衡量,发现醇质体制剂在卵磷脂为2%(v/v)、乙醇为45%(v/v)处方配比下,粒径小、粒径分布均匀和包封率高,雷公藤甲素醇质体中药物包封率达到了98%。2、采用各种烟酸甲酯和雷公藤甲素制剂透过大鼠皮肤SCE进入Franz扩散池来进行体外透皮实验。结果显示烟酸甲酯醇质体的24小时透皮累积量(74.0%)>空白醇质体/烟酸甲酯水醇溶液(54.2%)>水醇溶液(31.2%)>水溶液(17.4%)。透皮延迟时间显示,烟酸甲酯醇质体(无)﹤空白醇质体/水醇药物溶液混合物﹤水醇溶液﹤水溶液;时间分别为0、1、2、3小时。统计分析表明,烟酸甲酯四种剂型24小时透皮累积量比较,F=717.5,P<0.01,有显著性差异;两两比较,所有P值均<0.01,有显著性差异。雷公藤甲素各种制剂的通过SCE的体外透皮结果与烟酸甲酯的透皮相似。24小时透皮累积量的结果显示,雷公藤甲素醇质体达83.7%、空白醇质体/雷公藤甲素水醇溶液达59.4%、而水醇溶液达36.8%。透皮延迟时间分别为水醇溶液2 h、空白醇质体/水醇药物溶液混合物1 h、雷公藤甲素醇质体无。统计分析发现,雷公藤甲素三种剂型的24小时透皮累积量比较,F=170.3,P<0.01,有显著性差异;两两较,所有P值均<0.01,有显著性差异。3、研究采用一种反射分光光度法来评价外用空白醇质体可能引起的红斑。结果显示,空白醇质体的ΔEI与生理盐水溶液(对照)比较没有显著性差异,而水-乙醇混合溶液与醇质体制剂或生理盐水溶液相比有显著性差异(6h,24h,48h的F值分别为1562.7、1034.3、2814.6,p值均<0.01)。烟酸甲酯醇质体(此醇质体是未分离游离药物的烟酸甲酯醇质体)与其水醇溶液或者水溶液相比,以特别的高ΔEI值为特点,而且早期出现明显红斑,由烟酸甲酯醇质体引起的红斑指数变化曲线中可见,在1小时处产生一个峰,而后长达10小时内恒定。4、采用不同皮肤位点用烟酸甲酯制剂进行预处理诱发红斑,然后应用雷公藤甲素制剂,随之出现红斑消退现象。结果显示,雷公藤甲素醇质体比雷公藤甲素非醇质体溶液能更快地使红斑消退。烟酸甲酯制剂后,使用雷公藤甲素醇质体制剂处理3小时后的位点上发现诱发的红斑完全消退;水-乙醇混合溶液和雷公藤甲素的水溶液处理后的位点可见有诱发红斑的存在。实验中,同时采用空白醇质体进行观测醇质体制剂中的组分可能对化学诱发性红斑的干扰作用,结果发现空白醇质体没有诱发红斑的作用,同时空白醇质也无抗炎活性。5、MTT实验结果显示,ECV304细胞经不同浓度(5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L)的雷公藤甲素处理后,培养48小时后,ECV304细胞实验组与对照组相比均有不同程度的生长减缓,增殖受到不同程度的抑制。雷公藤甲素在试验浓度(5～30ug/L)内对ECV304细胞的细胞增殖具有明显的抑制作用,在一定范围内呈明显的浓度依赖性,即随着药物浓度的升高而其抑制率也增加。6、光镜下细胞形态学显示:5ug/L雷公藤甲素处理后,ECV304细胞镜下观察单位面积的细胞数量出现轻度的减少。在高浓度(30ug/L)作用后,镜下ECV304细胞单位面积的细胞数量显著减少,细胞间连接变少甚至消失,细胞间隙增大;细胞形态变圆或者外观形状不规则,细胞体积变小,胞膜呈现皱缩,胞浆减少,细胞核出现固缩,染色质聚集于细胞壁的边缘,部分呈月牙样,有些细胞裂解成为碎片状。尤其在高浓度状态时,上述镜下改变更为明显。未加雷公藤甲素处理的细胞无明显变化,仅出现少量的细胞漂浮。7、TRAP-ELISA法分别检测经不同浓度(5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L)处理的雷公藤甲素作用的ECV304细胞(48小时)的端粒酶活性。与对照组相比,各个处理组均受到明显的抑制,且随药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强。各加药组与对照组在统计学上有显著性差异(P<0.01),实验组(5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L)之间亦有统计学显著性差异(P<0.01)。结论1、采用薄膜水化法与超声法结合技术制备的醇质体,具有包封率高、透皮率好的优点,尤其适合脂质体药物载体。2、最优化处方显示,雷公藤甲素醇质体制剂在卵磷脂为2%(v/v)、乙醇为45%(v/v)处方配比下,粒径相对较小(50 nm左右)、粒径分布比较均匀、包封率高(达到了98%)。3、醇质体既没有诱发红斑作用也没有抗炎活,雷公藤甲素醇质体能增加雷公藤甲素的经皮渗透性,从而也增强在体模型皮肤的诱发红斑的抗炎活性,值得更深一步地研究。4、雷公藤甲素对ECV304细胞的增殖具有明显的抑制作用,并能显著下调端粒酶的活性。基于抗血管生成药物,雷公藤甲素醇质体有可能成为银屑病治疗的新产品。