目的:目前全世界有3.6亿人患有听力障碍,并且有逐年增加的发病趋势。中医则认为“火”、瘀”是突发性耳聋的主要病因,祖国医学在长期的耳聋诊治临床实践中摸索和积累了丰富的经验,运用清肝泻火法与活血化瘀法结合起来而形成泻火化瘀通窍法治疗突发性耳聋在临床治疗中获得很好的疗效,间接证明了泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI具有多靶点调控的作用,但是作用机制并不明确。研究证明,听力障碍主要是感音神经性聋,由血液循环障碍引起,尤其为耳蜗缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury,IRI)所致。最近的研究表明,耳蜗对内耳血流和氧供应的降低或中断极为敏感,耳蜗内氧自由基生成增多和细胞凋亡等因素,可能会导致耳蜗IRI—内耳结构和功能改变。耳蜗内氧自由基如果生成增多,会引起细胞膜功能的变化、细胞和细胞器功能的损伤。其中氧自由基和脂质过氧化物的降解产物丙二醛(MDA)可干扰蛋白质、糖和核酸的代谢,导致酶的活性下降、核酸的模板功能障碍和组织细胞结构损害;当过氧化物酶不足以清除体内氧自由基时,组织亦出现损伤,因此,氧自由基损伤与机体抗氧化酶活性有关,如过氧化氢酶(CAT)等。综上,CAT、MDA是评价耳蜗IRI的重要指标。研究证明,细胞凋亡是耳蜗IRI的一种主要细胞损伤形式。B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)是调控细胞增殖与凋亡状态的基因家族。Bcl-2为主要抗凋亡因子,Bax、Bad、Bak、Bid是促细胞凋亡基因,对Bcl-2产生阻抑作用。Bcl-2高表达时,可形成Bcl-2/Bax异源二聚体,能够抑制细胞凋亡。Bax高表达时,可形成Bax/Bax同源二聚体,促进细胞凋亡。若Bcl-2/Bax存在失衡,即凋亡和增殖的失衡可导致细胞凋亡加重。因此,耳蜗IRI与Bcl-2/Bax表达相关。凋亡的发生过程可通过内源性及外源性通路发生,它们都可通过激活Caspases使细胞亚结构降解。所以,Caspase是凋亡现象中的关键蛋白酶。在外源性凋亡通路中,Caspase-8参于诱导Caspase-3激活,启动类Caspase级联反应,然后活化执行类Caspase-6等,通过作用于细胞核,切割片层素蛋白,导致核纤层崩解,继而导致染色体凝集,即裂解特异性底物促进细胞凋亡。内源性凋亡通路中Caspase-9属于凋亡起始蛋白,它们剪切一系列的细胞亚结构最终导致细胞死亡。两条凋亡通路是相互独立又是紧密联系的。所以耳蜗IRI中Caspase-6、9是评价细胞凋亡损伤的重要指标。突发性耳聋属中医“暴聋”范畴,祖国医学在长期的临床实践中摸索中积累了丰富的经验,泻火化瘀通窍法在大量的临床研究获得了良好的疗效。本实验利用大鼠耳蜗iri模型,观察泻火化瘀通窍法对耳蜗的过氧化氢酶(cat)和丙二醛(mda)、细胞凋亡相关蛋白bcl-2/bax、bad、bak、bid及其凋亡调控蛋白caspase-6、9、12蛋白表达的影响,从分子水平探讨泻火化瘀通窍法在内耳iri中对耳蜗的保护作用,阐明依据中医“火”、“瘀”致病理论创立的泻火化瘀通窍法对耳蜗iri的调控机制,为其临床应用和作用机制提供实验依据。材料与方法:动物造模与分组:采用血管阻断法制备大鼠耳蜗缺血再灌注损伤(耳蜗iri)模型。将大鼠分成5组,即空白组、模型组、清肝泻火组、泻火化瘀通窍组、活血化瘀组,每组20只。实验方法:清肝泻火组:造模成功术后12h,予清肝泻火药物1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。泻火化瘀通窍组:造模成功术后12h,予泻火化瘀通窍药物1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。活血化瘀组:造模成功术后12h,1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。实验指标:(1)各组大鼠分别于造模后、用药前和用药后7d检测听觉脑干诱发电位abr阈值;(2)用解剖显微镜对耳蜗基底膜铺片毛细胞进行观察;(3)利用tba法和可见光法检测耳蜗组织mda及cat含量;(4)实时荧光定量pcr方法检测耳蜗组织bcl-2mrna、baxmrna表达;(5)用westernblot蛋白免疫印迹法检测bcl-2/bax、bad、bak、bid蛋白的表达;(6)实时荧光定量pcr方法检测耳蜗组织caspase-6mrna和caspase-9mrna表达;(7)westernblot法检测caspase-6、caspase-9、caspase-12蛋白的表达。统计学处理:数据用spss18.0软件处理,各组计量数据均以均数加减标准差sx)(?表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析;计数资料采用卡方检验。定义p<0.05为差别有显著性意义。结果:1.泻火化瘀通窍组治疗后听觉脑干诱发电位abr阈值显著低于模型组、清肝泻火组和行气活血化瘀组p<0.05。正常组的阈值最低,与其他组相比具有显著性差异p<0.05。2.耳蜗基底膜铺片基底膜外毛细胞显微结构观察显示:正常组基底膜外毛细胞分布呈三排,排列整齐,分布均匀,无明显缺失;模型组的外毛细胞受损严重,排列严重紊乱,崩解破坏,大片缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现极其严重的破坏、凋亡和坏死;清肝泻火组外毛细胞受损也较严重,排列紊乱,缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现破坏、凋亡以及坏死,活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐,部分变形,出现坏死;泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐,散在缺失,轮廓不清。模型组及清肝泻火组外毛细胞损伤较重,细胞出现凋亡,泻火化瘀通窍组及活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻,活血化瘀组损伤相对于泻火化瘀通窍组损伤明显。3.耳蜗iri可使耳蜗组织cat活性降低(p<0.05),泻火化瘀通窍组与活血化瘀组能增加cat活性(p<0.05),且泻火化瘀通窍组促进cat活力作用优于活血化瘀组(p<0.05)。4.耳蜗iri可使耳蜗组织mda活性升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组与活血化瘀组能显著抑制mda活性(p<0.05)。5.耳蜗iri可使耳蜗组织bcl-2mrna的表达量降低(p<0.05),泻火化瘀通窍组的bcl-2mrna的表达量明显高于模型及清肝泻火组(p<0.05)。6.耳蜗iri可使耳蜗组织baxmrna的表达量升高(p<0.05),活血化瘀组的baxmrna的表达比模型及清肝泻火组低(p<0.05);泻火化瘀通窍组的baxmrna的表达则显著低于模型组(p<0.05)。7.模型及清肝泻火组bcl-2蛋白的表达显著低于空白组(p<0.05);而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组bcl-2蛋白的表达均明显增加(p<0.05)。8.模型及清肝泻火组bax蛋白的表达显著高于空白组(p<0.05);而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组与模型及清肝泻火组相比,显著抑制bax蛋白蛋白的表达(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显著(p<0.05)。9.耳蜗iri使耳蜗组织caspase-6mrna的表达量升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组caspase-6mrna的表达量明显低于模型组(p<0.05)。10.耳蜗iri促进耳蜗组织caspase-9mrna的表达量升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组caspase-9mrna的表达量明显低于模型模型及清肝泻火组(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显著(p<0.05)。11.耳蜗iri促进耳蜗组织caspase-12mrna的表达量升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组caspase-9mrna的表达量明显低于模型组(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显著(p<0.05)。12.模型组caspase-6蛋白的表达显著高于空白组(p<0.05);而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组与模型及清肝泻火组相比,显著抑制caspase-6蛋白的表达(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显著(p<0.05)。13.模型组Caspase-9蛋白的表达显著高于空白组(P<0.05);与模型及清肝泻组相比,而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组显著降低Caspase-9蛋白的表达(P<0.05)。14.模型组Caspase-12蛋白的表达显著高于空白组(P<0.05);与模型组相比,而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组显著降低Caspase-12蛋白的表达(P<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显著(P<0.05)。15.泻火化瘀通窍和活血化瘀组GRP78蛋白低于模型及清肝泻火组(P<0.05),且泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显著(P<0.05)。结论:1.血管阻断法可用于建立大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型,该建模方法操作简单、可靠性高、造模成功率高、对动物的伤害小,模型动物均出现耳蜗缺血再灌注损伤,值得推广应用。2.大鼠耳蜗缺血再灌注损伤可显著提高听阈,模型建立成功后24h时听阈即显著增加(P>0.05),7d后听阈维持无明显变化。3.泻火化瘀通窍法具有缓解耳蜗缺血再灌注损伤、降低大鼠听觉脑干诱发电位和改善大鼠损伤后听力的作用。4.耳蜗IRI使耳蜗组织CAT活性降低,MDA含量升高,是听力受损的主因。5.在耳蜗IRI中,泻火化瘀通窍法显著增加CAT活性、降低MDA活性,从而加强抗脂质过氧化,减少脂质过氧化的作用,即纠正CAT/MDA氧化轴的失衡,改善耳蜗IRI中由膜脂质过氧化反应引发的自由基损伤。6.泻火化瘀通窍法能显著升高耳蜗组织中Bcl-2蛋白的表达、降低Bax蛋白表达,纠正Bcl-2/Bax凋亡轴的失衡,起到抑制细胞凋亡的作用。7.泻火化瘀通窍法能显著降低耳蜗组织中Caspase 6、Caspase 9及Caspase 12蛋白的表达,通过抑制外源凋亡执行蛋白和内源凋亡启动蛋白表达,阻抑细胞凋亡,从而在内耳IRI中发挥对耳蜗的保护作用。综上所述,本研究阐明泻火化瘀通窍法纠正CAT/MDA氧化轴失衡、Bcl-2/Bax凋亡轴的失衡、抑制凋亡相关蛋白Caspase-6、Caspase-9、Caspase 12执行凋亡的活性,通过抗细胞氧化应激和凋亡机制,抗耳蜗缺血再灌注损伤,为临床突发性耳聋的诊治提供理论依据。