负载Mg2+的透明质酸/甲壳素温敏性水凝胶用于软骨修复的研究

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目的:制备一种可注射温敏性天然高分子水凝胶,用于骨软骨修复,促进骨软骨生成。方法:1)材料制备与性能表征:配制质量比为m(HA)/m(HPCH)=1:6和m(HA)/m(HPCH)=1:12两种配比的HA/HPCH水凝胶,凝胶浓度均为2%(m/v),并分别命名为HA/HPCH-1和HA/HPCH-2。用场发射扫描电镜(SEM)观察凝胶样品HPCH、HA/HPCH-1、HA/HPCH-2的表面形貌。分别HA/HPCH-1和HA/HPCH-2两组水凝胶中引入了Mg2+,Mg2+浓度均为5 m M,并分别命名为Mg2+/HA/HPCH-1、Mg2+/HA/HPCH-2。采用瓶倒转法测定几种水凝胶在PBS溶液中的溶胶-凝胶相转变温度,采用称量法研究凝胶的在4周时间内的降解情况。2)HA/HPCH复合水凝胶用于骨软骨修复相关细胞实验:采用(CCK-8)法评价HPCH、HA/HPCH-2、Mg2+/HA/HPCH-2凝胶的生物相容性。为了探究材料对细胞的黏附能力,本实验将材料与HUVEC细胞悬浮液共孵育,用PBS洗去未吸附细胞,Live-Dead活死细胞染色法观察剩余细胞的密度。将BMSC细胞与HPCH、HA/HPCH-2、Mg2+/HA/HPCH-2三种水凝胶共培养,并用CCK-8法检测细胞增殖率。用场发射扫描电镜(SEM)观察Mg2+/HA/HPCH-2凝胶-BMSC细胞的表面形貌。3)复合水凝胶材料对软骨修复作用的体内研究:将32只3kg新西兰大白兔,做膝关节软骨缺损模型后随机分成A、B、C、D四组,每组8只,A组注射生理盐水,B组注射单纯HPCH水凝胶,C组注射HA/HPCH-2复合水凝胶,D组注射Mg2+/HA/HPCH-2水凝胶。分别于12W、24W取材做HE染色、番红O-固绿染色,并对每个切片进行关节软骨缺损组织学评分。结果:SEM显示水凝胶材料呈现出多孔,疏松的鳞片状结构,这些结构相互连通,有利于软骨附着。各组水凝胶与BMSC三维培养后的SEM图显示,图上显示有较多丝状结构,系是间充质干细胞的伪足,说明细胞可很好的附着在凝胶上。各组水凝胶具有温敏性,凝胶的sol-gel相转变温度在22℃左右,且随着凝胶中HA含量的上升,凝胶的sol-gel相转变温度提高。各组材料具有降解性,28天后降解率均在60%以上。各组材料的细胞毒性很小,有良好的生物安全性。HPCH中加入少量HA和Mg2+对材料的黏附性没有明显影响;而单纯的HA组黏附的细胞相对于HPCH、HA/HPCH-2、Mg2+/HA/HPCH-2组有显著的减少,说明HA的细胞黏附效果较差。在凝胶-细胞共培养24 h后,各组细胞数量大约增长了15%,在培养48 h后,各组细胞增殖了60%,说明2%的支架材料在37℃下形成凝胶没有对BMSC细胞有损伤,细胞在凝胶网络中生长情况良好。动物实验24W取材后大体观察、HE染色、番红O-固绿染色可知,HPCH/HA/Mg2+组修复软骨缺损的效果最好,HPCH/HA修复效果次之,单纯HPCH也有一定的软骨修复效果,组织学评分各组具有明显差异。结论:Mg2+/HA/HPCH复合可注射水凝胶材料具有良好的温敏性、降解性、细胞附着性、生物相容性,可促进有效促进软骨缺损的修复,具有良好的应用前景。
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