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七氟烷(Sevoflurane)是新生儿及儿童临床上最常应用的全身麻醉药(General Anesthetics)[1,2],其对小儿发育期大脑的神经毒性受到广泛关注,但具体机制尚不清楚。研究表明,儿童期多次暴露于全身麻醉药物更易造成其发育期大脑的神经毒性,从而影响其远期学习记忆能力(Learning ability)[3-5],而Tau蛋白磷酸化在其认知功能损伤的发生发展中具有重要的作用[6-9]。近年来,有研究指出,非微管结合Tau蛋白(Microtubule-unbound Tau,MUT),可能是Tau蛋白代谢异常(磷酸化及异常聚集)的早期标志,而能量及Nuak1(Nuak family SNF1-like kinase 1)对其有调控作用[10,11]。本课题以Nuak1/Tau信号通路为切入点,深入研究七氟烷多次麻醉对幼年及成年小鼠认知功能及神经损伤的影响,并探讨其分子机制,同时寻求相关脑保护方法。实验一:七氟烷多次麻醉对不同年龄小鼠认知功能改变及Tau蛋白表达的影响目的:七氟烷多次麻醉可致幼年小鼠远期认知功能障碍,Tau蛋白过度磷酸化可造成神经损伤,而非微管结合Tau蛋白可能是Tau蛋白早期代谢的标志。本实验拟探讨七氟烷多次麻醉对幼年(P6)及成年(P60)小鼠远期认知功能改变及不同类型Tau蛋白及其磷酸化位点表达的影响。方法:出生6 d(P6)及出生60 d(P60)小鼠各52只随机分为4组(n=26/组):幼年对照组(P6+Control)、幼年七氟烷组(P6+Sevoflurane)、成年对照组(P60+Control)、成年七氟烷组(P60+Sevoflurane)。其中七氟烷组给予3%七氟烷+60%O2处理,每天2 h,连续3 d,对照组只给予60%O2处理,每天2 h,连续3 d。七氟烷连续处理后22 d,对不同组小鼠(P30,P84)进行Morris水迷宫实验检测其认知功能;七氟烷连续处理后0 d(P8,P62),取小鼠海马及皮层组织,应用ELISA检测total Tau表达、RT-PCR检测Tau m RNA表达、Western blot检测total Tau(Tau46),T22(Tau蛋白早期聚合物,可溶性低聚体,oligomers)Tau-PS202/PT205(PHF-Tau),Tau-PS356(R4)表达、微管结合实验检测不同类型Tau蛋白(微管结合Tau蛋白及非微管结合Tau蛋白)表达、荧光染色检测Tau蛋白早期聚集(T22)、串联质谱分析检测Tau蛋白不同磷酸化位点表达。结果:1.七氟烷多次麻醉可致幼年小鼠远期认知功能损伤,而对成年小鼠没有影响;2.幼年小鼠皮层和海马组织中Tau m RNA及total Tau蛋白表达均高于成年小鼠;3.幼年小鼠皮层及海马组织T22及Tau-PS356表达明显高于成年小鼠,七氟烷处理可使幼年小鼠皮层及海马Tau-PS202/PT205表达增加,而成年小鼠则没有差异;4.幼年小鼠海马及皮层主要为非微管结合Tau蛋白,而成年小鼠主要为微管结合Tau蛋白;5.幼年小鼠脑片中可在其大脑皮层发现Tau蛋白早期聚集(可溶性低聚体,T22),而成年小鼠脑片不见聚集;6.七氟烷多次麻醉可致幼年小鼠皮层大部分Tau蛋白位点磷酸化增强,而对成年小鼠影响不大。结论:幼年小鼠与成年小鼠相比,其发育期大脑更易遭受到七氟烷多次麻醉的打击,造成Tau蛋白多位点磷酸化增加,从而影响其远期认知功能,其机制与非微管结合Tau蛋白表达密切相关。实验二:Nuak1在七氟烷多次麻醉所致发育期小鼠大脑神经毒性中的关键作用目的:2016年,一项新研究指出,Nuak1(Nuak family DNF1-like kinase 1,又叫做AMPK related protein 5,ARK5)可通过选择性磷酸化位于Tau蛋白重复序列(R4)上的Ser356位点,从而调节Tau蛋白代谢。本实验拟通过探讨Nuak1对Tau蛋白的调控作用,通过应用Nuak1特异性阻滞剂HTH-01-015,拟证明Nuak1在七氟烷多次麻醉所致发育期小鼠大脑神经毒性中的关键作用。方法:出生6 d(P6)及出生60 d(P60)小鼠各12只随机分为4组(n=6/组):幼年对照组(P6+Control)、幼年七氟烷组(P6+Sevoflurane)、成年对照组(P60+Control)、成年七氟烷组(P60+Sevoflurane),相关处理同实验一。多次麻醉后0 d(P8,P62)后立即处死小鼠,提取其海马及皮层组织,应用RT-PCR及Western blot检测不同年龄组小鼠大脑皮层及海马Nuak1基因及蛋白表达、应用串联质谱(MS/MS)分析Nuak1不同磷酸化位点表达;另选80只P6小鼠,随机分为4组(n=20/组):对照+溶剂组(Control+Vehicle)、七氟烷+溶剂组(Sevoflurane+Vehicle)、对照+Nuak1阻滞剂组(Control+HTH-01-015)、七氟烷+Nuak1阻滞剂组(Sevoflurane+HTH-01-015)。七氟烷及氧气处理同上,所有P6小鼠于七氟烷麻醉及氧气处理前30 min,腹腔注射(i.p.)Nuak1特异性阻滞剂HTH-01-015(10 mg/kg)或者溶剂(生理盐水+DMSO)100μL/次,连续注射3 d,并于七氟烷处理后22 d(P30)通过Morris水迷宫实验检测认知功能;于七氟烷及氧气处理后0 d,取皮层及海马组织,通过Western blot实验检测Nuak1、total Tau(Tau46)、T22、Tau-PS356及Tau-PS202/PT205表达、通过免疫荧光染色检测T22蛋白聚集情况、通过微管结合实验检测不同类型Tau蛋白(微管结合Tau蛋白及非微管结合Tau蛋白)表达。结果:1.幼年小鼠大脑皮层及海马Nuak1蛋白表达明显高于成年小鼠,而Nuak1基因表达(m RNA)与成年小鼠相比没有统计学意义;2.串联质谱分析得出,幼年小鼠Nuak1只有2个磷酸化位点(Nuak1-PS389,Nuak1-PS446)表达,并且幼年小鼠皮层组织Nuak1磷酸化表达明显低于成年小鼠;3.给予Nuak1特异性阻滞剂HTH-01-015后,对于幼年小鼠,七氟烷多次处理并没有造成其远期认知功能损伤;4.给予Nuak1特异性阻滞剂后,幼年小鼠大脑皮层及海马Nuak1及total Tau表达没有差异,而Tau-PS356、Tau-PS262/PT205表达与对照+溶剂组相比均降低,且七氟烷处理并不能使其增加;5.给予Nuak1阻滞剂后,幼年小鼠皮层及海马中的非微管结合Tau蛋白明显减少,Tau蛋白早期聚集明显降低。结论:Nuak1通过选择性磷酸化位于重复序列R4上的Tau-PS356,使Tau蛋白与微管解离,从而增加非微管结合Tau蛋白含量,七氟烷多次麻醉可刺激非微管结合Tau蛋白,从而激活GSK3β,正反馈形成超磷酸化,从而产生神经毒性,以致远期认知功能障碍。而Nuak1含量受自身磷酸化调节,其在脑中的蛋白表达与其自身磷酸化成反比。实验三:能量不足(Energy deprivation)在七氟烷多次麻醉致小鼠发育期大脑神经毒性中的作用目的:研究指出,能量不足(Energy deprivation)和氧化应激(Oxidative stress)可能是导致Tau蛋白磷酸化聚集的主要原因[12]。本实验通过应用维生素K2(一种能量补充剂),拟证明能量在七氟烷所致小鼠发育期大脑神经毒性中的作用。方法:出生6 d(P6)及出生60 d(P60)小鼠各12只随机分为4组(n=6/组):幼年对照组(P6+Control)、幼年七氟烷组(P6+Sevoflurane)、成年对照组(P60+Control)、成年七氟烷组(P60+Sevoflurane),相关处理同实验一。多次麻醉后0d(P8,P62)处死小鼠,提取皮层组织,利用ATP检测试剂盒检测不同年龄组小鼠ATP表达;另选80只P6小鼠,随机分为4组(n=20/组):对照+玉米油组(Control+Corn oil)、七氟烷+玉米油组(Sevoflurane+Corn oil)、对照+维生素K2组(Control+Vitamin K2)、七氟烷+维生素K2组(Sevoflurane+Vitamin K2)。七氟烷组小鼠给予3%七氟烷+60%O2处理,每天2 h,连续3 d,对照组只给予60%O2处理,每天2 h,连续3 d。所有P6小鼠于七氟烷麻醉及氧气处理前30 min,腹腔注射(i.p.)Vitamin K2(100 mg/kg)或者玉米油100μL/次,连续注射3 d,并于七氟烷处理后22 d(P30)通过Morris水迷宫实验检测认知功能;于七氟烷及氧气处理后0 d,取皮层及海马组织,通过ELISA检测total Tau表达、通过Western blot实验检测Nuak1、total Tau(Tau46)、T22、Tau-PS356,Tau-PS202/PT205表达、通过免疫荧光染色检测Tau蛋白聚集情况、通过微管结合实验检测不同类型Tau表达。结果:1.幼年小鼠皮层的ATP表达明显低于成年小鼠,且七氟烷刺激可使ATP明显降低;2.给予Vitamin K2后,对于P6小鼠,七氟烷多次处理并没有造成其远期认知功能损伤;3.给予Vitamin K2后,P6小鼠大脑皮层及海马total Tau蛋白表达没有差异,而Nuak1、Tau-PS356、Tau-PS262/PT205表达与对照+玉米油组相比均降低,且七氟烷处理并不能使其增加;4.给予Vitamin K2后,幼年小鼠皮层及海马中的非微管结合Tau蛋白明显减少,Tau蛋白早期聚集(T22)明显消失。结论:幼年小鼠大脑皮层及海马能量表达明显低于成年小鼠,而能量不足(能量剥夺)本身可以激活AMPK,使得Nuak1表达增加,从而使得Tau蛋白,特别是非微管结合Tau蛋白的含量增加,造成神经脆弱性(Neuronal vulnerability),形成Tau蛋白早期聚集,由此,在七氟烷多次麻醉的刺激下,Tau蛋白大量脱微管,磷酸化甚至超磷酸化,从而造成神经发育损伤,影响远期认知及学习功能。小结1.七氟烷多次麻醉可造成幼年小鼠远期认知功能障碍,对成年小鼠没有影响;2.幼年小鼠发育期大脑中主要表达非微管结合Tau蛋白,而成年小鼠大脑主要表达微管结合Tau蛋白;3.幼年小鼠发育期大脑皮层中Tau蛋白早期聚集造成神经脆弱性,在七氟烷多次麻醉下形成Tau蛋白大量位点超磷酸化,从而造成神经损伤;4.Nuak1通过选择性磷酸化Tau-PS356以调节Tau蛋白代谢,在七氟烷多次麻醉致小鼠发育期大脑神经毒性中起关键作用;5.幼年小鼠大脑ATP含量远远低于成年小鼠,能量严重不足;6.能量不足可使Nuak1磷酸化降低,从而使Nuak1表达增加,并造成幼年小鼠发育期大脑神经脆弱性,可能是七氟烷多次麻醉致小鼠发育期大脑神经损伤的根本原因。