实验背景：随着经济社会的发展及人们饮食结构的改变,动脉粥样硬化导致的缺血性疾病也不断威胁着人们的健康,其引起的冠状动脉粥样硬化性心脏病以及外周血管疾病等导致的心肌梗死,下肢动脉闭塞等逐渐引起人们的重视。虽然介入治疗及外科手术的发展可以在一定程度上进行血运重改善部分病人的症状,但对于部分因血管病变较重或合并其他疾病等不适合手术治疗的患者而言,新的治疗方法的运用将会带来更多的临床获益。研究发现,缺血局部组织产生的侧枝循环会明显减轻机体缺血症状,改善预后。但其自身的生理过程缓慢,不能完全满足缺血组织的需要,因此人为的增加局部的促血管再生的因子的浓度则可以更大程度上的促进机体新生血管的形成,明显改善缺血症状,获得更多收益,也就是“治疗性血管再生”(therapeutic angiogenesis)。目前已有很多因子被认为可以应用于这项治疗中,包括血管内皮生长因子(VEGF),成纤维生长因子(FGF)等等。目前对胸腺肽β4 (Thymosinβ4,Tβ4)的研究已发现其在血管再生中发挥了重要的作用,无论是体外还是在体试验均发现Tβ4可以促进内皮细胞的增殖,迁移及增强管腔形成能力,并且还可以通过促进内皮祖细胞的分化,归巢等过程促进新生血管形成,Tβ4低表达时则血管新生明显受到影响。目前已有的研究发现VEGF,PI3K,ERK等信号通路均有可能参与在Tβ4发挥作用过程中,但具体过程仍不能明确,并且目前对缺血机体自身产生的Tβ4随着缺血过程发展而发生的变化也尚无明确研究。Notch信号通路是在进化中高度保守的信号通路,其在细胞的分化,增殖,迁移,血管形成,动静脉分化以及器官形成等各个过程均发挥了重要的作用,其在胚胎形成阶段的重要作用使得人们认为Notch与其他信号一起决定了细胞的最终命运。Notch表达的缺失将明显影响血管形成的过程,导致功能性血管形成减少,并影响血管功能,并且在此过程中Notch与VEGF通路相互作用并影响,共同参与血管再生过程。而在Tβ4促进血管再生的过程中是否有Notch通路参与其中及其在此过程中发挥的可能的作用目前尚无相关研究。实验目的：本实验主要研究缺血机体自身的Tβ4水平与体内血管再生的关系以及Notch通路在Tβ4促进HUVECs迁移及管腔形成中的作用。实验方法：体外实验中,以脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,经不同浓度胸腺肽β4(Tβ4) (0,0.1,0.5, 1ug/ml)及不同时间(0,4H,8H,12H,24H)处理后,通过Western blot方法检测Cleaved-Notchl, Notch4表达量改变,再经DAPT抑制Notch活性后,予Tβ4处理HUVECs后,通过Western blot方法检测血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮钙粘连蛋白(VE-cadherin)表达,并通过Matrigel实验观察HUVECs在有或无DAPT抑制情况下,Tβ4促进管腔形成能力的改变；采用划痕实验判断Notch活性抑制前后Tβ4促进内皮细胞迁移能力的变化；通过将分离好的人淋巴细胞种于HUVECs上,经过transwell实验分析Notch通路抑制前后Tβ4对内皮细胞间连接的影响。设计合成siRNA分别干扰Notch1及Notch4表达,转染HUVECs后,再用Tβ4处理,通过matrigel检测管腔形成情况,transwell中穿过内皮细胞的淋巴细胞数目判断内皮细胞间连接的变化。在动物体内实验中,以C57 6-10周雄性小鼠为研究对象,结扎右侧下肢股动脉,建立下肢缺血模型,假手术组则单纯分离股动脉,正常小鼠,术后1天,1周,2周时分别通过心尖取血法收集血液并取下肢腓肠肌,经elisa方法检测小鼠血液中Tβ4表达量的变化,Western blot方法检测缺血不同时间后小鼠VEGF表达含量的变化,及免疫组化方法测定CD31表达改变,判断新生血管数量。临床试验中,选择275名于本院心内科住院并行冠脉造影的患者,根据冠脉造影结果及Rentrop评分分为造影正常组,侧支循环较差组和侧性循环较好组3组,所有患者于行冠脉造影前静脉抽血2ml,血清通过elisa方法检测Tβ4表达量的情况。实验结果：经不同浓度和不同时间的Tβ4作用后,HUVECs中的Cleaved-Notch1及Notch4表达量均增加,且在浓度为0.5ug/ml作用24小时最明显,经DAPT抑制Notch活性后,VEGF表达量较未抑制组明显减少,而经Tβ4作用后,不论用DAPT抑制与否VE-cadherin表达量均明显减少,matrigel验证管腔形成能力实验结果显示Tβ4可以刺激管腔形成,而经DAPT抑制Notch活性后Tβ4促管腔形成能力及内皮细胞迁移能力明显降低,也不再能增加跨HUVECs的淋巴细胞的数量。经Western blot测定siRNA转染后的HUVECs的Notch1及Notch4表达量,选定抑制率最高的siRNA序列,分别抑制Notch1及Notch4表达后,再将抑制后的细胞种于Matrige1上,均加入Tβ4作用12H后,显微镜下观察发现抑制Notch1及Notch4组管腔形成能力明显较阴性对照组减低,但较正常细胞管腔生长能力强,同样,转染抑制后的transwell实验也发现经Tβ4作用后跨过的淋巴细胞较未抑制组的明显减少,而分别转染抑制Notch1及Notch4的两组间无明显差别。小鼠体内实验中,经elisa检测血液中Tβ4含量发现,术后1天,小鼠体内Tβ4表达量开始升高并持续到1周时仍保持在较高水平,而2周时明显减低,但较正常小鼠比仍明显增高,术后1天及1周时VEGF表达量均增高,而2周时明显减低,但与正常小鼠相比仍明显升高,差异有统计学意义(p<0.05),免疫组化分析CD31表达检测小血管生成发现,术后1天及1周时CD31表达明显增多,而术后2周则明显减少,但仍有表达。患者血清标本检测Tβ4提示侧枝循环较差组与较好组间含量有明显差别(分别为1024.50±516.92ng/ml,1373.00±1082.88 ng/ml),回归分析提示Tβ4与侧支评分间显著相关(p<0.05)。结论：1.Tβ4作用于HUVECs时影响了Notch信号通路中Notch1及Notch4的表达,并使其表达量增加。2. Notch1及Notch4参与了Tβ4促进HUVECs管腔形成的过程,阻断Notch活化则Tβ4作用减弱,但仍有部分作用。3. Notch活性受到抑制时Tβ4促进HUVECs内皮细胞迁移的作用明显减低,VEGF及VE-cadherin表达明显减少。4.缺血体内新生血管形成数量同VEGF及Tβ4表达正相关,Tβ4促进新生血管形成的下游机制可能与VEGF有关。