本试验旨在对课题组前期研制的替代饲用抗生素的中草药提取物对致病菌的抑菌作用机制进行初步探讨,并研究大肠杆菌对中草药提取物的耐药性以及该提取物对抗生素耐药大肠杆菌的逆转作用,为中草药提取物应用于替代饲用抗生素提供较完善的理论依据。研究方法：1.中草药提取物抑菌机理研究。采用牛津杯法对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行体外抑菌试验,以抑菌圈直径作为评价指标;采用试管稀释法测定中草药提取物对致病菌的最低抑菌浓度(MIC),二者共同评价致病菌对中草药提取物和抗生素的敏感性,并用抗生素作为试验对照。从细胞膜、细胞壁的完整性和蛋白含量几方面研究抑菌机制。用浓度为1/2倍、1倍和2倍MIC的中草提取物处理菌体,通过测定细菌培养液中碱性磷酸酶活性以评价中草药提取物对细菌细胞壁的影响;采用分光光度法和钙试剂盒测定菌体胞内钙离子、核酸、离子的外泄量;用蛋白试剂盒测定菌体胞内蛋白的外泄量,并与不添加药物组比较。2.大肠杆菌对中草药提取物的耐药性研究。在低药物浓度下连续传代培养大肠杆菌,通过牛津杯法和试管稀释法评价经传代培养的大肠杆菌对中草药提取物和抗生素的敏感性,以观察大肠杆菌对中草药提取物和抗生素是否产生耐药性。3.中草药提取物对大肠杆菌抗生素耐受性的逆转作用研究。在低药物浓度下连续传代培养耐受抗生素的大肠杆菌,以抑菌圈直径大小和最低抑菌浓度为指标,判断耐药菌的耐药性是否发生逆转。结果如下：1.中草药提取物抑菌机理研究。体外抑菌试验结果表明,三种中草药提取物对致病菌均有一定的抑制作用,其中乌梅提取物的抑菌作用更为突出。对三种中草药抑菌机制进行初步探索,发现经中草药提取物处理过的菌体,细菌培养液电导率、大分子物质含量、钙离子浓度、碱性磷酸酶含量以及可溶性蛋白含量均有所上升,菌体受破坏的程度与中草药浓度呈现正相关,说明中草药提取物的抑菌机理是通过破坏细菌细胞膜、壁的完整性、影响蛋白含量而起作用,并且复方乌梅提取物主要是影响了细胞膜的通透性,而五倍子提取物的则是通过影响可溶性蛋白含量和细胞壁的完整性来起作用,乌梅提取物的作用机制有待进一步探讨。2.大肠杆菌对中草药提取物的耐药性研究。耐药性试验结果表明,大肠杆菌在低浓度的含药培养基中传代培养,传代菌对抗生素会产生的耐受性,但对中草药提取物基本不产生耐药性。3.中草药提取物对大肠杆菌抗生素耐受性的逆转作用研究。中草药提取物对耐药大肠杆菌的逆转试验,结果发现乌梅、五倍子、复方乌梅这三种中草药提取物虽可部分降低大肠杆菌对阿莫西林的耐受程度,但不能完全逆转菌体对抗生素的耐药性。结论;中草药提取物对致病菌生长的抑制作用是通过破坏细菌细胞膜和细胞壁的完整性,改变菌体蛋白含量而产生的。大肠杆菌对中草药提取物基本不产生耐药性,但中草药提取物不可完全逆转细菌的耐药性。因此应再筛选其它具有抑菌性能的中草药作用于耐药菌株,对耐药菌体的耐药性进行分析讨论,以获得具有逆转作用的中草药提取物,为开发细菌耐药性抑制剂和逆转剂提供理论基础。结论: