帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种老年人常见的慢性神经退行性疾病。常见于50岁以上老年人,并且随着年龄的增加发病率逐渐增高。其主要临床表现为震颤、肌张力增高、运动迟缓和姿势异常。中脑黑质(SN)多巴胺神经元进行性变性坏死和黑质纹状体通路多巴胺含量减少是其病理特点。PD的确切病因尚不完全清楚,目前的多巴胺替代治疗虽然可以缓解症状,但是随着用药时间的延长疗效逐渐降低,同时也不能阻止黑质多巴胺神经元的进行性变性和进展。因此探讨和阐明PD的病因和发病机制,寻求和开发新的治疗药物减缓或阻止疾病的进展是治疗PD的希望。近年来越来越多的证据表明炎症是介导黑质多巴胺神经元死亡的决定性因素,以小胶质细胞激活为特征的神经炎症在PD的发病机制中起重要作用。细菌脂多糖(LPS)是一种强烈的炎症刺激物和小胶质细胞激活剂,它和其他神经毒素如MPTP、6-OHDA不同。LPS并不直接杀伤多巴胺神经元,而是通过激活小胶质细胞释放一系列的促炎症反应因子和细胞毒性因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、反应性氧自由基(ROS)以及前列腺素(PG)等导致神经元变性。提示LPS诱导的多巴胺神经元变性是研究炎症反应在PD发病机制中作用的理想模型。但是这些因子在LPS诱导的多巴胺神经元变性中的作用研究结果不一,实际上炎症导致黑质神经元死亡是一个十分复杂的过程,这些因子之间也存在相互影响和相互作用,故确定主要的分子通路对筛选PD的治疗药物是十分重要的。环氧化酶(COX)是花生四烯酸代谢产生PG过程中的主要限速酶,COX同功酶之一COX-2是一种重要的炎症介质,炎症反应伴随COX-2表达增加和前列腺素E2(PGE2)水平增高与许多神经疾病的病理过程中神经元的变性和凋亡有关。但是研究PD炎症机制的理想模型-LPS诱导的多巴胺神经元变性中COX-2的作用尚不清楚,COX-2是否确实介导了了DA神经元炎症损伤,高度选择性COX-2抑制剂是否抑制该损伤途径,目前尚未见报道。明确LPS介导的多巴胺神经元变性中COX-2的作用机制以及细胞和分子通路将会为PD的治疗提供新的方向。本研究首先使用LPS处理中脑原代培养体系观察了COX-2的细胞起源、COX-2表达的变化以及选择性COX-2抑制剂塞来昔布对多巴胺神经元的保护作用;其次建立了黑质内注射LPS诱导的多巴胺神经元变性的动物炎症模型,使用免疫印迹技术研究黑质内注射LPS大鼠不同时间点COX-2蛋白表达的变化;并进一步研究了塞来昔布是否在体内对黑质多巴胺神经元有保护作用,探讨COX-2在炎症介导的多巴胺神经元变性中的作用以及机制。1、体外细胞培养中COX-2介导LPS对多巴胺神经元的毒性作用目的:中脑原代细胞培养中LPS诱导的多巴胺神经元变性是体外研究PD的神经炎症机制和筛选有效的PD抗炎药物的理想模型。使用中脑原代细胞培养建立炎症介导的DA神经元变性的体外模型,使用此模型探讨COX-2选择性抑制剂塞来昔布对多巴胺神经元的保护作用及其机制。方法:孕14d SD大鼠胚胎中脑原代培养7d后,分别加入溶剂或COX-2选择性抑制剂塞来昔布20μM预处理30min,然后加入LPS(20ng/ml)培养72h,对中脑原代培养细胞固定进行免疫荧光染色,取上清液进行放免法测定PGE2和TNF-α。结果:LPS能明显减少TH-ir细胞数目,仅为对照组的48%;塞来昔布预处理后存活的TH-ir神经元数增加,为对照组的69%。单独塞来昔布处理对TH-ir细胞数目无明显影响。形态上分析塞来昔布也能显著改善LPS对TH-ir细胞的损伤程度;同时发现LPS能增加小胶质细胞数目到对照组的3.48倍;部分小胶质细胞体积增大、形态不规则。塞来昔布预处理后小胶质细胞数目仅为对照组的2倍,不规则形态细胞也显著减少;另外塞来昔布预处理后COX-2免疫阳性细胞密度也较LPS组明显减少。双标记法发现COX-2阳性细胞为小胶质细胞;对照组中脑原代培养上清液中PGE和TNF-α的水平分别为65.27±33.13pg/ml和10.75±0.09pmol/L,LPS能明显增加上清液中PGE2和TNF-α的水平(分别为531.65±69.59pg/ml和13.24±0.62 pmol/L,P<0.05),塞来昔布能抑制LPS诱导的PGE2和TNF-α含量的增加(190.52±73.10pg/ml,11.19±0.52 pmol/L,P<0.05)。结论: LPS刺激小胶质细胞激活,增加其表达COX-2和分泌PGE2、TNF-α,导致DA神经元的变性。塞来昔布通过抑制小胶质细胞激活以及COX-2表达,减少细胞外PGE2、TNF-α水平发挥其神经保护作用。COX-2涉及中脑原代培养中LPS诱导的多巴胺神经元变性过程。2、黑质内注射LPS对多巴胺神经元的毒性作用目的:观察黑质内注射脂多糖(LPS)对多巴胺神经元的毒性作用,探讨帕金森病的炎症机制。方法:35只SD大鼠随机分为5组,分别为正常组、6h组、24h组、14d和30d组。使用立体定向技术黑质内注射15μg LPS,采用免疫组织化学方法观察注射后不同时间点大鼠黑质TH-ir细胞的减少以及小胶质细胞的形态学变化。结果:LPS注射后6h、24h、14d、30d TH-ir细胞存活率分别为对侧的90.1±7.05%(和对照组比较P>0.05),57.4±5.72%,16.0±5.84%,14.9±5.74%(和对照组比较均P<0.05,其中24h和6h、14d、30d比较P<0.05;14d和30d比较P>0.05)。黑质小胶质细胞6h出现部分激活,24h和14d激活达高峰,30d时又恢复静止状态。结论:黑质内注射LPS能诱导小胶质细胞激活,随后导致时间依赖性的多巴胺神经元变性。它是研究神经炎症和多巴胺神经元变性的关系的一种理想的实验研究模型。3、LPS诱导的大鼠黑质多巴胺神经元变性中COX-2蛋白表达目的:使用黑质内注射LPS的PD炎症模型,观察LPS诱导的大鼠多巴胺神经元变性过程中黑质COX-2蛋白表达和PGE2水平的变化。方法:60只SD大鼠随机分为5组,分别为黑质内注射PBS组、黑质内LPS注射后6h组、24h组、14d组和30d组。在黑质立体定向注射15μg LPS后不同时间点分别使用免疫组化方法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目的变化,免疫印迹法检测黑质COX-2蛋白表达以及放射免疫方法测定PGE2水平。结果:LPS注射后6h TH-ir细胞数目和对照组无明显变化,24h显著减少,14d达到高峰;黑质COX-2蛋白表达在6h即开始增高(194.34±9.68A),24h继续增高(211.23±7.05A),14d达到高峰(256.07±16.32A),在30d仍高于对照组(162.9±75.03A),和对照组(90.79±11.59A)比较差异有显著性意义(P均<0.05)。黑质和血PGE2水平虽然增加,但并不和COX-2蛋白表达平行,黑质和血PGE2水平分别在注射后6h、24h达到高峰。结论:LPS诱导的黑质多巴胺神经元变性过程中存在COX-2蛋白表达增加。4、塞来昔布对LPS诱导的多巴胺神经元变性的保护作用目的:进一步探讨选择性COX-2抑制剂塞来昔布在体内对LPS诱导的多巴胺神经元变性的保护作用及其机制。方法:30只SD大鼠随机分成3组:磷酸缓冲液(PBS)对照组、生理盐水+LPS组和塞来昔布+LPS组。黑质内立体定向注射15μg LPS或PBS,塞来昔布或生理盐水治疗组在注射LPS前3h开始灌胃,剂量为20ml.kg-1.d-1,盐水组灌注等量生理盐水,持续到注射后14d。采用免疫组织化学方法观察注射后14d大鼠TH-ir细胞的减少以及小胶质细胞的形态学变化,免疫印迹法检测黑质COX-2蛋白表达以及放射免疫方法测定PGE2和TNF-α水平。结果:与PBS注射组(98.14±9.48%)相比,生理盐水治疗组TH-ir细胞数存留率减少到15.99±5.84%(P<0.05),黑质COX-2蛋白表达以及PGE2、TNF-α含量明显增加(分别为255.92±16.34A ,1.77±0.41pg/mg和14.76±0.49pmol/L),大部分小胶质细胞呈激活形态;而塞来昔布治疗组TH-ir细胞数较生理盐水治疗组明显增多,存留率为43.00±18.39%(P<0.05),黑质COX-2蛋白表达以及PGE2、TNF-α水平明显减少(分别为95.85±8.77A,0.95±0.33pg/mg和12.61±0.39pmol/L),并且明显抑制小胶质细胞激活。结论:塞来昔布在体内通过COX-2途径抑制小胶质细胞激活以及神经毒性因子的释放,阻止多巴胺神经元的变性和丢失。COX-2涉及体内炎症介导的多巴胺神经元变性机制。总之,LPS对DA神经元的毒性作用机制中存在COX-2、小胶质细胞和变性坏死的DA神经元之间的恶性循环。首先LPS刺激小胶质细胞激活,激活的小胶质细胞高度表达COX-2,同时分泌一些神经毒性因子如TNF-α等导致DA神经元的损伤;而COX-2的高度表达产生大量的PG和ROS,又加剧小胶质细胞的激活和DA神经元的变性死亡,损伤的DA神经元也能反过来激活小胶质细胞,如此的恶性循环造成DA神经元的持续和进行性变性。而COX-2抑制剂通过抑制COX-2活性抑制小胶质细胞激活和PG、TNF-α的产生减轻这个恶性循环发挥其神经保护作用。建议COX-2在LPS诱导的DA神经元变性中发挥重要的作用,针对COX-2靶点的药物可能成为治疗PD的一种选择。