研究背景和研究目的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)属于副粘病毒科,肺炎病毒属,是婴幼儿最常见下呼吸道感染病原体,多数感染发生在1岁以内,几乎所有儿童在2岁前都曾遭受过RSV感染。全世界每年新发5岁以下儿童RSV感染毛细支气管炎、肺炎约3400～6400万例,约造成5～20万儿童死亡,严重危害儿童健康,是婴儿期死亡的重要原因之一。儿童RSV感染后发生反复喘息,甚至以后发生哮喘的几率也增加。因无特效抗RSV药物,临床治疗RSV毛细支气管炎多采用综合治疗,以对症支持疗法为主。目前尚缺乏安全有效的RSV疫苗。临床及动物实验均提示RSV感染的气道炎症反应是原发病毒感染损害和免疫损伤共同作用的结果。目前对RSV感染后的免疫损伤机制尚不明确,研究提示:RSV感染毛细支气管炎患儿存在Th1/Th2失衡,IFN-γ、TNF-α、L-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13等多种Th1和Th2类细胞因子参与了气道炎症。固有免疫在RSV感染气道炎症中的作用近年来也开始受到关注白介素-33(interleukin-33,IL-33)于2003年最初报道在高内皮细胞微静脉中发现,被称为“高内皮细胞来源的核因子”(nuclear factor-high endothelial venules,NF-HEV)。2005年被确定为IL-1家族的成员。IL-33在正常细胞内持续大量表达,当人体的屏障细胞内皮细胞或上皮细胞在遭受创伤或炎症而发生损伤或坏死时释放到细胞外,同时发挥促进适应性免疫和固有免疫的作用,被视为警报素家族新成员。IL-33的特异性受体——生长刺激表达基因2(growth stimulation expressed gene2,ST2),在其配体被发现10多年前,早已作为孤儿受体被关注。IL-33作为细胞因子作用于其特异性受体ST2,通过IL-33/ST2信号通路发挥作用。IL-33 受体复合物为异源二聚体 ST2L/IL-1RAcP(IL-1R accessory protein,IL-1受体辅助蛋白)。IL-33与受体复合物结合后,募集细胞内信号分子髓样分化因子 88(myeloid differentiationfactor88,MyD88)、肿瘤坏死因子相关因子 6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)、白介素受体相关激酶(interleukin receptor associated kinase,IRAKs),活化的 TRAF6、IRAK1、4,激活下游的核因子-κB(nuclear factor-κ B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)p38、细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK)及c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK),促进多种炎性因子的基因表达,促进IL-5、IL-13等Th2类细胞因子产生。IL-33/ST2信号通路在某些情况下是否特异性的激活MAPK系统或NF-κB目前尚不清楚。近年来的研究发现,IL-33可以在一定条件下通过促进Th1型免疫应答,发挥抗病毒活性,还可以极化天然辅助细胞(2型固有淋巴样细胞)、Treg细胞、CD8+T细胞、NK细胞等多种免疫细胞。目前IL-33在RSV感染气道炎症中的作用尚不明确。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是广泛存在于真核细胞内的信号传递网络,将不同的信号刺激传递至细胞核内,通过调控基因表达,参与细胞的生长、分化、凋亡及炎症反应等多种生理及病理过程。包括ERK、JNK和p38,其中,ERK有5个亚族,ERK1～ERK5,目前研究提示ERK1和ERK2存在较为广泛,研究也较为清楚,其分子量分别为44kDa和42kDa。核因子-K B(NF-K B)是炎症反应中重要的调控转录因子,包括p65、p50、p52、Rel和RelB5个亚单位。在细胞浆内多与抑制蛋白结合,以无活性复合物形式存在,由信号分子降解其抑制蛋白,使NF-κB活化,进入胞核影响基因转录,参与免疫反应的早期、炎症反应及细胞调亡等病理生理反应。研究发现,在某些细菌感染中,IL-33发挥保护性作用;在部分病毒感染中,IL-33 一方面能够促进炎症反应,另一方面又可能通过调节Treg细胞发挥促进组织修复的作用。大量证据表明,IL-33/ST2信号通路在支气管哮喘的发病中发挥促进炎症反应的作用。RSV感染毛细支气管炎与支气管哮喘存在相似的免疫病理状态,都有Th1/Th2免疫失衡存在。SaraviaJ等从RSV感染急性期婴儿的鼻咽分泌物中测得IL-33、IL-13升高;但也有RSV感染患儿的鼻咽分泌物中IL-33是降低的报道。我们推测RSV可能直接损害气道上皮细胞,导致IL-33的释放;进而通过IL-33/ST2通路激活MAPK或NF-κ B,诱导或加重气道炎症反应。本研究首先进行体外细胞培养,探索RSV感染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-33表达释放的规律。继而用滴鼻法建立RSV感染SD幼鼠模型,测定RSV感染SD幼鼠肺泡灌洗液中IL-33浓度及肺组织IL-33mRNA的表达量。通过对RSV感染SD幼鼠应用抗IL-33中和抗体处理,观察处理后实验动物肺组织病理切片,收集BALF进行细胞计数、分类,测定其血浆中Th1类细胞因子IFN-γ及Th2类细胞因子 IL-5、IL-13,并检测肺组织 ST2、P-ERK1/2、P-JNK、P-p38 和 P-p65-NF-κ B的蛋白表达量,探讨IL-33抗体在RSV感染气道炎症中的作用机制,为临床诊治RSV感染毛细支气管炎提供新的思路。方法1.细胞培养利用Hela细胞培养制备RSV A病毒悬液并调定病毒滴度。复苏培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ),收集RSV病毒感染大鼠AECⅡ后3h、12h、24h细胞培养上清液,ELISA测定IL-33的浓度;提取AECⅡ细胞RNA,实时荧光定量PCR测定AEC Ⅱ在RSV感染3h、12h、24h时IL-33 mRNA的表达。2.动物实验3～4周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为4组,空白对照组、RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组,每组10只。利用滴鼻法,连续2d在每侧鼻孔内滴入0.5 μl/g滴度为5 X 104TCID50/0.1ml的RSV病毒悬液,建立RSV感染SD幼鼠动物模型。空白对照组SD幼鼠,鼻孔内滴入无病毒培养基,作为阴性对照。RSV+抗-IL-33组,RSV病毒悬液首次滴鼻前3h及第2次滴鼻后12h,分2次,分别给予抗-IL-33中和抗体鼻腔内滴入作为治疗。RSV+IgG组,给予IgG经鼻腔内滴入作为治疗对照。实验第4d处死所有SD幼鼠。留取肺组织标本,对RSV感染SD幼鼠肺组织大体标本及HE染色病理切片进行观察,并收集BALF进行细胞计数、分类。ELISA测定SD幼鼠血浆中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ、IL-5、IL-13及肺泡灌洗液中IL-33浓度。采用实时荧光定量PCR检测肺组织IL-33mRNA和ST2mRNA的表达量,应用Westernblot检测肺组织 ST2、P-ERK1/2、P-JNK、P-p38 和 P-P65-NF-κB 的蛋白表达量。结果1.RSV感染大鼠AECⅡ细胞IL-33mRNA及细胞培养上清液中IL-33的测定RSV感染大鼠AECⅡ IL-33mRNA的相对表达量较同一时间点对照组明显增高,P<0.05,差别有显著统计学意义。RSV感染大鼠AECⅡ上清液IL-33浓度较同一时间点对照组明显增高,P<0.05,差别有显著统计学意义。2.RSV感染后SD幼鼠肺组织大体标本肉眼观空白对照组肺组织大体标本呈淡粉色,表面光滑。RSV感染组和IgG处理组肺组织充血均明显,可见不规则的充血区及广泛散在的出血点。IL-33抗体处理组,病变较轻,肺大体标本可见散在少许充血区。3.肺组织HE染色病理切片空白对照组肺组织结构清晰,支气管粘膜上皮完整,肺泡壁光滑。与对照组比较,RSV感染组及IgG处理组SD幼鼠支气管粘膜上皮结构紊乱,粘膜下层增厚,细支气管上皮细胞坏死,管腔狭窄,肺组织有大量淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞浸润,肺泡壁增厚、肿胀。RSV+IL-33抗体处理组,病变较轻,少量炎性细胞浸润,上皮细胞病变坏死较轻,粘膜下层轻度增厚,肺泡壁略增厚。4.气道炎症半定量评分RSV+抗-IL-33组气道炎症评分低于RSV感染组和RSV+IgG组,但高于空白对照组,差别均有统计学意义(P<0.05)。RSV感染组与RSV+IgG组间气道炎症评分无显著差别。5.血浆细胞因子的测定与空白对照组相比,RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组SD幼鼠的血中IL-5、IL-13及IFN-γ水平均增高。RSV+抗-IL-33组IL-5、IL-13水平低于RSV感染组以及RSV+IgG组,P<0.05,差别均有统计学意义;IL-5、IL-13在RSV感染组与RSV+IgG组间差别无显著统计学意义。IFN-γ水平在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组均高于空白对照组,P<0.05,差别有统计学意义;在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组间的两两比较差别均无统计学意义。IFN-γ/IL-5比值,在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组以及RSV+IgG组比值均低于空白对照组,P<0.05,差别有统计学意义;RSV+抗-IL-33 组 IFN-γ/IL-5 比值高于 RSV 感染组以及 RSV+IgG 组,P<0.05,差别有统计学意义;RSV感染组与RSV+IgG组间IFN-γ/IL-5比值差别无显著统计学意义。6.肺泡灌洗液IL-33及肺组织IL-33mRNA的测定与空白对照组比较,RSV感染组SD幼鼠肺泡灌洗液中IL-33浓度增加,P<0.05,差别有显著统计学意义。RSV感染组SD幼鼠肺组织中IL-33mRNA的相对表达量较空白对照组明显增高,差别有显著统计学意义7.BALF细胞计数及分类与空白对照组相比,RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组SD幼鼠BALF中炎性细胞均较空白对照组增多。RSV+抗-IL-33组BALF中炎性细胞的计数低于RSV感染组以及RSV+IgG组,P<0.05,差别均有统计学意义;BALF中炎性细胞的计数在RSV感染组与RSV+IgG组间差别无显著统计学意义。BALF中细胞分类的比较显示:RSV+抗-IL-33组BALF中淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的比例均低于RSV感染组以及RSV+IgG组,P<0.05,差别均有统计学意义;在RSV感染组与RSV+IgG组间BALF淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞比例差别无显著统计学意义。RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组SD幼鼠的BALF中巨噬细胞比例均低于空白对照组,RSV+抗-IL-33组BALF中巨噬细胞比例高于RSV感染组以及RSV+IgG组,P<0.05,差别均有统计学意义;在RSV感染组与RSV+IgG组间BALF中巨噬细胞比例差别无显著统计学意义。8.肺组织ST2mRNA及ST2的蛋白相对表达量肺组织ST2mRNA及ST2蛋白的表达量在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组均高于空白对照组;而在RSV+抗-IL-33组低于RSV感染组及RSV+IgG组,P<0.05,差别均有显著统计学意义。肺组织ST2mRNA及ST2蛋白的表达量在RSV感染组和RSV+IgG组间差别无统计学意义。9.肺组织中MAPK蛋白的相对表达量肺组织P-ERK1/2相对表达量各组间差别无统计学意义(P>0.05)。肺组织P-JNK及P-p38蛋白的表达量在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组均明显高于空白对照组;而在RSV+抗-IL-33组则低于RSV感染组及RSV+IgG组,P值均<0.05,差别有显著统计学意义。肺组织P-JNK、P-p38蛋白的表达量在单纯RSV感染组和RSV+IgG组间差别无统计学意义。10.肺组织中NF-κB蛋白的相对表达量肺组织P-p65-NF-κB蛋白的表达量在RSV感染组、RSV+抗IL-33组、RSV+IgG组均明显高于空白对照组;而在RSV+抗-IL-33组则低于RSV感染组及RSV+IgG组,P<0.05,均有显著统计学差别。肺组织P-p65-NF-κ B蛋白的表达量在RSV感染组和RSV+IgG组间差别无统计学意义。结论1.RSV诱导大鼠ACEⅡ IL-33表达上调。2.RSV感染SD幼鼠模型肺组织IL-33表达增加。3.IL-33作为一种前炎症性细胞因子在RSV感染SD幼鼠的气道炎症中通过IL-33/ST2通路,活化JNK、P38信号通路及NF-κB,导致Th2类细胞因子IL-5、IL-13的表达增加,促使机体的免疫状态发生Th2偏移,促进气道炎症反应。4.IL-33中和抗体治疗通过封闭IL-33,下调ST2表达,阻断IL-33/ST2通路,减轻JNK、P38信号通路及NF-κ B的活化,抑制机体Th2偏移,发挥减轻RSV感染SD幼鼠气道炎症反应的作用。