恶性肿瘤是威胁人类健康的第一大疾病,每年导致数千万人失去生命,且患病人数逐年增加。化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的有效手段之一,但是传统的小分子化疗药物仍存在药效低、半衰期短、副作用严重等缺陷。蛋白质药物具有特异性强、生物活性高等优点,在肿瘤治疗中发挥巨大的潜力。目前临床上使用的蛋白质药物都是通过靶向细胞表面受体或者细胞外特定结构发挥功能。然而,绝大多数生化反应都在细胞内进行,作用于胞内靶点的蛋白质药物具有更广阔的应用前景,但其胞内递送面临着诸多挑战。（1）作为细胞隔绝外界物质的天然屏障,细胞膜可阻止包括蛋白质在内的大分子进入细胞。（2）现有绝大多数蛋白质递送体系都通过内吞作用进入细胞。如果它们无法从溶酶体逃逸,将被降解成氨基酸或通过胞吐作用返回胞外,严重限制其在胞内发挥药理作用。（3）蛋白质进入细胞后无法充分发挥生物活性。为了实现高效的胞内递送,通常需要将载体与蛋白质形成稳定复合物,缺乏有效的胞内释放机制会对限制其发挥药理作用。本论文针对上述关键问题,发展了小分子修饰的蛋白质前药,实现了蛋白质前药的无载体化肿瘤细胞靶向胞内递送,显著提升了蛋白质药物在体内外的抗肿瘤功效。本论文按照以下几个方面进行研究:第一章概述了恶性肿瘤发展和治疗概况,介绍了蛋白质药物在肿瘤治疗中的现状和挑战,系统阐述了不同蛋白质胞内递送体系以及蛋白前药的优势和缺陷。第二章发展了一种联合糖代谢工程以及生物正交反应的蛋白质胞内递送系统,用于肿瘤靶向治疗。通过四酰基化-N-叠氮乙酰基甘露糖胺（AAM）对肿瘤细胞进行叠氮基标记,该标记方法具有普适性,可在多种肿瘤细胞膜表面引入了大量的叠氮基人工受体。通过DBCO-NHS与蛋白质赖氨酸残基上的伯氨基团反应,制备了多种不同分子量（12.4 kDa-67 kDa）以及等电点（4.7-10.3）的DBCO-蛋白质前药。其中,毒素蛋白核糖核酸酶A（RNase A）经DBCO修饰后其活性仍高于80%。通过DBCO与叠氮基团高效的生物正交反应,增强了 DBCO-蛋白前药在多种肿瘤细胞中的摄取（～370 ng DBCO-protein/mg protein）。进一步研究发现DBCO-蛋白的细胞摄入是能量依赖的主动运输过程,且主要通过小窝蛋白介导的内吞作用进入细胞。进入细胞后,水解核糖核酸（RNA）,导致肿瘤细胞死亡。在B16F10（小鼠皮肤黑色素瘤细胞）荷瘤小鼠模型中,瘤内注射AAM与RNase A-DBCO可显著抑制肿瘤生长,小鼠生存期延长至38天,且抗肿瘤功效显著优于单独注射RNase A-DBCO组。第三章发展了一种L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）介导的无载体化蛋白质前药胞内递送体系,实现了蛋白质在肿瘤细胞中高效、高选择性的胞内递送。使用4-硝基苯基4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环硼戊烷-2-基）碳酸苄酯（N）以及3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（P）依次对蛋白质进行修饰,制备具有ROS响应性的蛋白质前药PN-protein。PN-protein的胞内递送具有高度的肿瘤细胞普适性和选择性,其在五种肿瘤细胞中的内化率超过35%,而在三种正常细胞中内化率均低于5%。此外,PN-protein通过LAT1的转运作用直接进入细胞,无需经过内吞途径,不会被内涵体/溶酶体捕获。该递送体系成功将13种具有不同分子量（12.4kDa-430 kDa）和等电点（4.3-10.8）的蛋白质递送进入细胞,且递送效率远高于商业化试剂PULSin。进入肿瘤细胞后,胞内高浓度的活性氧（ROS,100 μM H2O2）使蛋白质前药中的响应性基团脱落并迅速恢复活性（＞80%）,从而发挥其生物学功能。基于该策略,毒性蛋白皂草素前药（PN-saporin）在体外4T1（小鼠乳腺癌细胞）细胞和体内4T1荷瘤小鼠中表现出优异的抗肿瘤性能,而对正常细胞/组织无毒副作用。该策略也实现了基因编辑蛋白CRISPR-Cas9核酸酶前药PN-RNP的高效胞内递送,在稳定转染GFP的HeLa细胞中实现了高效的基因敲除（～55%）。第四章对硕士论文进行了总结并展望了后续可以开展的工作。综上所述,本硕士论文发展了两种用于肿瘤靶向的无载体化蛋白质胞内递送体系,并探索了其在抗肿瘤治疗及基因编辑中的应用,获得了一系列有创新意义的研究结果,为发展新型的蛋白质胞内递送体系提供了一定的参考意见。