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溶血磷脂酸受体信号和miR-23a在心肌细胞肥大中的相互调节背景：心肌梗死后心肌肥大是心梗后心室重塑中心肌细胞的主要病理改变,是心力衰竭发生的独立危险因素。深入了解心肌肥大的调节机制,有助于寻找预防心力衰竭的新靶点。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid, LPA)是一种内源性的生物活性磷脂信号分子,主要通过特异性的G蛋白耦联受体(LPA1-LPA6)调节多种生物学效应。研究组以往的研究发现心肌梗死患者血清中LPA水平升高近6倍。动物和细胞实验发现心肌细胞主要表达LPA1和LPA3两种受体亚型,并表明LPA1和／或LPA3受体可能通过调节心肌细胞肥大参与心梗后的心室重塑。然而,LPA1和LPA3受体在调节心肌细胞肥大中的亚型特异的功能作用至今尚未明确。近来研究发现一类内源性微小核糖核酸-miRNAs可以在转录后水平参与调节多种生物学功能,包括心肌肥大。但miRNA是否参与LPA受体信号调节的心肌细胞肥大尚不清楚。我们运用Targetscan搜索以LPA受体为靶基因的潜在miRNA,发现LPA1mRNA3’非翻译区(3’-UTR)可以与miR-23a的种子序列互补结合。鉴于研究报道miR-23a可以诱导心肌细胞肥大,因此我们推(?) miR-23a可能通过靶向抑制LPA1受体参与调节LPA诱导的心肌细胞肥大。目的：本研究旨在明确LPA1和LPA3受体信号在LPA诱导的心肌细胞肥大中的亚型特异的功能作用以及miR-23a是否参与LPA诱导的心肌细胞肥大。方法：本研究以体外分离培养的原代乳鼠心肌细胞为实验对象,以心肌细胞肌丝集束、细胞表面积、胚胎基因ANP、BNP和β-MHC mRNA表达和核周ANF释放为心肌细胞肥大评价指标。运用鬼笔环肽染色标记心肌细胞肌丝并计算细胞表面积、定量RT-PCR检测ANP、BNP和β-MHC mRNA水平、免疫荧光染色显示核周ANF释放。运用小RNA干扰技术转染心肌细胞分别敲低LPA1和LPA3,并用免疫印迹和定量RT-PCR分别检测LPA1和LPA3的蛋白和mRNA水平。运用Pre-miRNA23a和miR-23a inhibitors转染心肌细胞分别过表达和敲低miR-23a, TaqMan定量RT-PCR检测miR-23a表达水平。运用双荧光素酶报告系统验证miRNA的靶基因。利用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT信号通路,免疫印迹检测磷酸化蛋白表达。结果：本研究结果显示：1)运用小RNA干扰技术敲低LPA1受体促进了LPA诱导的心肌细胞肥大,表现为肌丝集束增加,细胞表面积增大,ANP和BNPmRNA水平升高,核周ANF释放增加,说明LPA1受体负性调节LPA诱导的心肌细胞肥大；2)敲低LPA3受体抑制LPA诱导的心肌细胞肥大,表现为肌丝集束减少,细胞表面积减小,ANP和BNP mRNA水平降低,核周ANF释放减少,表明LPA3受体正性调节LPA诱导的心肌细胞肥大;3)LPA诱导心肌细胞miR-23a表达上调,敲低miR-23a抑制LPA诱导的心肌细胞肥大,表明miR-23a参与了LPA诱导的心肌细胞肥大；4)荧光素酶报告系统分析显示Pre-miRNA23a转染HEK293T细胞导致LPA1受体mRNA的3’-UTR端的荧光素酶活性降低近50%。同时,过表达miR-23a抑制LPA1的蛋白和mRNA表达水平,而敲低miR-23a增加LPA1蛋白和mRNA表达水平,说明LPA1受体是miR-23a的一个新的靶基因；5)LPA1/3受体非选择性阻断剂Ki16425抑制LPA诱导的心肌细胞肥大,并抑制了LPA诱导的]miR-23a的表达上调。同时,LPA3受体激动剂OMPT促进心肌细胞肥大,并促进了miR-23a的表达上调。更重要的是,运用小RNA干扰技术敲低LPA3受体几乎完全抑制了LPA诱导的miR-23a表达上调,而敲低LPA1受体对LPA诱导的miR-23a表达上调抑制作用不明显,说明LPA3介导了LPA诱导的miR-23a表达上调；6)PI3K抑制剂LY294002不仅阻断了LPA诱导的心肌细胞肥大,同时还抑制了LPA诱导的miR-23a的表达上调,表明PI3K/AKT参与了LPA诱导的miR-23a的表达上调。结论：本研究表明LPA1和LPA3受体对LPA诱导的心肌细胞肥大起着相反的调节作用,miR-23a通过靶向抑制LPA1参与了LPA诱导的心肌细胞肥大。本研究揭示了LPA受体信号和miR-23a在心肌细胞肥大中的一种新的调节机制,可能为心梗后心力衰竭的防治提供潜在新的干预靶点。溶血磷脂酸对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响及信号调控机制背景：再灌注治疗是急性心肌梗死的最佳治疗手段。然而,再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡是心梗后心力衰竭发生的重要影响因素。寻找抗心肌缺血再灌注损伤的保护药物可能为心梗后心力衰竭的防治提供新的治疗靶点。溶血磷脂酸(LPA)作为细胞外一种信号分子,主要通过特异性的G蛋白耦联受体(LPA1-LPA6)调节多种生物学效应。研究组以往研究发现LPA对无血清缺血诱导的骨髓间充质干细胞凋亡具有显著的抑制作用。其他课题组研究也报道LPA可以对抗缺再灌注诱导的组织或器官损伤。然而,LPA对缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤的影响仍不明确。目的：本研究旨在探讨LPA对缺氧／复氧诱导的心肌细胞损伤的影响及信号调控机制。方法：本研究主要以H9c2心肌细胞株为主要实验对象,H9c2心肌细胞缺氧/复氧细胞损伤模型模拟心肌缺血再灌注损伤,运用台盼蓝染色和MTS法分别检测活细胞数和细胞存活率,Hoechst33342染色显示凋亡细胞形态,流式细胞双染检测凋亡细胞。采用LPA1/3受体阻断剂Ki16425阻断LPA1/3受体,PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂分别阻断PI3K/AKT和ERK1/2信号通路。并且用免疫印迹检测凋亡相关蛋白和磷酸化蛋白表达。结果：与缺氧/复氧组相比,LPA预处理组明显提高了H9c2心肌细胞活细胞数和细胞存活率,减少了细胞凋亡比例,其中以10μM浓度的LPA作用最为明显,说明LPA抑制缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤。并且结果显示：与缺氧/复氧组相比,10μM LPA预处理组明显降低了缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞的Caspase-3/7活性和裂解的Caspase-3蛋白表达水平,促进了线粒体抗凋亡蛋白Bcl-2表达,抑制了线粒体抑凋亡蛋白Bax的表达,提高了Bcl-2/Bax蛋白表达比例,提示LPA可以通过调节线粒体途径抑制缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡。机制研究发现：与LPA预处理组相比,LPA1/3受体阻断剂Ki16425组抑制LPA的抗缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤的作用,表现为细胞存活率减低,Bcl-2表达减少,Bax表达增加,Bcl-2/Bax蛋白比例降低,并减少了裂解的Caspase-3蛋白表达水平,提示LPA1/3受体参与了LPA的抗缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的作用。另外,本研究还发现PI3K抑制剂LY294002抑制了LPA的抗缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤的作用,而ERK抑制剂U0126对LPA的抗损伤作用抑制并不明显,表明PI3K/AKT信号通路参与了LPA的抗H9c2心肌细胞损伤的作用,而ERK1/2信号通路可能并不参与LPA的抗缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤的作用。结论：LPA可以通过激活LPA1/3受体及PI3K/AKT信号通路调节线粒体途径从而抑制缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤,提示LPA可能是一种潜在的抗心肌缺血再灌注损伤的保护药物。