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目的:将不同浓度JAK2激酶抑制剂AG490作用于人红白血病(human erythroleukemia,HEL)细胞,观察其对HEL细胞增殖、凋亡,细胞迁移能力的影响及对VEGF、HIF-1α蛋白表达的变化,探讨AG490能否通过抑制JAK2-STAT5信号通路抑制血管新生因子VEGF和HIF-1α表达,为抗血管新生治疗恶性血液病提供理论依据。方法:1.实验分组:空白对照组(未加用AG490组),实验组(加用不同浓度AG490组)。根据AG490不同终浓度,实验组又分为:20μmol/L AG490组,40μmol/L AG490组,60μmol/L AG490组,80μmol/L AG490组,100μmol/L AG490组。2.应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测AG490对HEL细胞活力的影响。3.应用Hoechst荧光染色法观察AG490对HEL细胞凋亡形态的变化。4.应用流式细胞技术检测AG490对HEL细胞凋亡的影响。5.Transwell小室实验检测AG490对HEL细胞迁移的影响。6.应用半定量-聚合酶链反应(RT-PCR)检测AG490对HEL细胞JAK2的m RNA表达水平的影响。7.应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测AG490对HEL细胞p-JAK2、VEGF及HIF-1α的蛋白表达水平的影响。8.统计学分析:数据以均数±标准差(`x±S)表示,通过SPSS19.00统计软件分析。Transwell实验数据比较采用t检验,细胞活力、荧光染色、流式细胞术、RT-PCR和Western blot结果数据比较采用方差分析,组间数据比较选用q检验,两变量的相关程度用Pearson直线相关分析法分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.CCK-8法检测AG490对HEL细胞活力的影响CCK-8实验结果显示:20μmol/L AG490组、40μmol/L AG490组、60μmol/L AG490组、80μmol/L AG490组、100μmol/L AG490组作用HEL细胞后,在不同时间各组细胞活力如下:24h时分别为:(97.2±0.6)%、(82.4±0.5)%、(70.5±0.5)%、(59.2±0.2)%、(41.9±0.3)%;48h时分别为:(88.3±0.5)%、(75.1±0.4)%、(48.8±0.6)%、(21.2±0.2)%、(10.2±0.1)%;72h时分别为:(69.9±0.4)%、(31.4±0.2)%、(19.6±0.3)%、(5.4±0.1)%、(1.5±0.1)%。随着孵育时间的延长,实验组HEL细胞活力呈现明显降低趋势,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);同一时间不同实验组HEL细胞活力明显不同,且随着AG490药物浓度不断增大,HEL细胞活力明显降低。2.Hoechst33342荧光染色法观察AG490作用于HEL细胞后细胞形态的变化荧光染色结果显示:处理HEL细胞48h后,实验组HEL细胞出现凋亡,细胞核由于浓集而呈现亮蓝色,核固缩或核变形。空白对照组HEL细胞Hoechst着色为淡蓝色,细胞核内DNA分布均匀,核呈圆形或者卵圆形,无固缩,无变形。空白对照组、20μmol/L AG490组、40μmol/L AG490组、60μmol/L AG490组、80μmol/L AG490组、100μmol/L AG490组亮蓝色细胞数分别为:10.2±0.8、15.3±0.9、21.6±1.2、34.8±1.6、49.2±1.9、63.3±2.4,实验组与空白对照组相比,亮蓝色细胞明显增多,并且随着药物浓度的增加,亮蓝色细胞数量明显增加,且有显著性差异(P<0.05)。3.流式细胞术检测AG490对HEL细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示:处理HEL细胞48h后,空白对照组、20μmol/L AG490组、40μmol/L AG490组、60μmol/L AG490组、80μmol/L AG490组、100μmol/L AG490组HEL细胞凋亡率分别为:(2.44±0.16)%、(5.34±0.31)%、(8.71±0.51)%、(10.22±0.83)%、(16.63±1.22)%、(23.33±1.40)%。与空白对照组相比,实验组细胞出现明显凋亡,并且随着AG490药物浓度的增加,凋亡细胞比率逐渐上升(P<0.05)。4.Transwell小室实验检测AG490对HEL细胞迁移的影响结果显示,20μmol/L AG490作用细胞24h后漏入下室的细胞数(51.6±2.9)明显少于空白对照组(71.6±4.5),具有统计学差异(P<0.05)。5.RT-PCR方法检测AG490对HEL细胞JAK2 m RNA表达水平的影响RT-PCR结果显示:处理细胞48h后,空白对照组、20μmol/L AG490组、40μmol/L AG490组、60μmol/L AG490组、80μmol/L AG490组、100μmol/L AG490组HEL细胞JAK2 m RNA相对表达水平分别为:0.98±0.07、0.93±0.06、0.65±0.03、0.52±0.02、0.32±0.02、0.12±0.01。实验组JAK2的m RNA表达较空白对照组明显减低,并随着药物浓度的增加而逐渐减低,较空白对照组有统计学意义(P<0.05)。6.Western blot法检测AG490对HEL细胞p-JAK2、VEGF、HIF-1α的蛋白表达水平的影响Western blot结果显示:孵育细胞48小时后,空白对照组、20μmol/L AG490组、40μmol/L AG490组、60μmol/L AG490组、80μmol/L AG490组、100μmol/L AG490组p-JAK2蛋白条带相对灰度分别为:1.228±0.090,1.185±0.081,1.020±0.065,0.915±0.063,0.693±0.035,0.286±0.012。VEGF蛋白条带相对灰度分别为:1.029±0.051,0.896±0.043,0.743±0.021,0.598±0.019,0.465±0.012,0.214±0.005;HIF-1α蛋白条带相对灰度分别为:0.977±0.048,0.893±0.037,0.702±0.052,0.658±0.045,0.427±0.021,0.259±0.010,β-actin蛋白表达水平在空白对照组和各实验组中无明显差异。实验组HEL细胞p-JAK2蛋白水平逐渐减低的,均明显低于空白对照组。VEGF和HIF-1α的蛋白水平随着药物浓度的增加逐渐下降,较空白对照组有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果:VEGF与p-JAK2相关系数r=0.991,二者呈正相关(P<0.05);HIF-1α与p-JAK2相关系数r=0.993,亦呈正相关性(P<0.05)。结论:1 HEL细胞存在JAK2V617F突变及JAK2信号通路活化。2 JAK2抑制剂AG490能够抑制HEL细胞活力,且具有时间及剂量依赖性。3 JAK2抑制剂AG490能诱导HEL细胞凋亡。4 AG490能够抑制HEL细胞的迁移能力。5 AG490可通过抑制JAK2信号通路,明显抑制p-JAK2、VEGF和HIF-1α的表达,并进一步参与抑制血管新生作用。